I類整合子在多重耐藥鮑曼不動桿菌中的作用研究

胡曉波,郭海艷,胡傳璽,瞿躍紅,李 漫,王 瑛,張建軍

(1.上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院檢驗科,上海201900;2.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院,上海200011)

鮑曼不動桿菌是造成院內感染的重要條件致病菌,可引起廣泛的嚴重感染[1]。近年來隨著抗生素的大量使用,鮑曼不動桿菌的耐藥率逐步上升,并已有廣譜耐藥鮑曼不動桿菌的出現,給臨床治療帶來極大困難[2]。研究顯示,在耐藥鮑曼不動桿菌中檢測到的多數耐藥基因常位于整合子基因盒中。整合子是細菌基因組中的可移動遺傳物質,可將許多耐藥基因整合在一起,從而形成多重耐藥[3]。其中 I類整合子在桿菌的耐藥中扮演著重要的角色。I類整合子的結構由5-CS、3-CS及中間的可變序列組成。5-CS攜帶編碼整合酶基因int I和一個啟動子基因片段,3-CS包括3個開放閱讀框架(ORF):季銨鹽化合物溴乙錠耐藥基因(qacEA1)、磺胺耐藥基因(sul I)和功能尚不清楚的ORF[4-8]。

本實驗收集臨床分離的鮑曼不動桿菌株,用M IC法檢測鮑曼不動桿菌的耐藥性,然后采取PCR法檢測I類整合子的基因。針對I類整合子保守序列設計擴增引物,將整合子可變區域的全長序列擴增出來,分析得到插入 I類整合子中對應的耐藥基因。最后統計分析耐藥組和不耐藥組的差異性。本研究希望能建立一種快速簡便的I類整合子檢測方法,監測鮑曼不動桿菌的耐藥性及耐藥基因攜帶情況,及時發現新的耐藥基因,指導臨床用藥、促進感染的恢復、減少濫用抗生素。

1 材料和方法

1.1 試驗菌株 收集上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院2007年9月至2009年9月從痰液、尿液、咽拭和引流液等標本分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌共63株。標準菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)。

1.2 菌株培養和分離 用麥康凱血平板培養分離出Gram陰性桿菌,采用生物梅里埃的Gram陰性菌鑒定板條鑒定鮑曼不動桿菌。M IC法檢測鮑曼不動桿菌的耐藥性,抗生素處理組包括:頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢呋辛、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林+棒酸、哌拉西林+他唑巴坦、替卡西林+棒酸、美洛培南、亞胺培南、復方新諾明、妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素、奈替米星、環丙沙星。

1.3 細菌DNA的提取 從血平板上挑取單個菌落,加入到50μl雙蒸水中,制成細菌懸液,100℃水浴10 min。然后以10 000 rpm/min離心5 min,取1 μl上清液作為DNA模板。

1.4 I類整合子 PCR擴增 整合子引物序列:Sense 5′-TCTCG GGTAA CATCA AGG-3′,antisense 5′-AAGCA GACTT GACCT GA-3′。擴增條件:95℃預變性5 min,然后94℃30 s,60℃30 s,72℃1min,循環30次,最后72℃延伸10min。

1.5 PCR產物的純化和測序 PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳,120mV 1 h,溴化乙啶染色,在透射紫外儀下照相觀察。隨后對凝膠當中的PCR產物進行切膠回收并送出測序。測序結果在GenBank網上比對查詢。

1.6 統計學方法 用Fisher確切概率計算法對整合子陽性與整合子陰性鮑曼不動桿菌的耐藥率進行比較,統計兩者差異是否有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR擴增I類整合子基因

63株鮑曼不動桿菌中整合子陽性35株(56%),整合子陰性28株(44%),PCR擴增片段長度均約為2 300 bp。圖1當中列出了1-16號鮑曼不動桿菌樣本中I類整合子的擴增結果。

圖1 1-16號鮑曼不動桿菌樣本中I類整合子的擴增結果

2.2 藥物敏感實驗結果 I類整合子陽性菌株對11種抗生素耐藥率高于 I類整合子陰性菌株,耐藥率見表1。顯示整合子陽性菌株對頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢呋辛、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林+棒酸、哌拉西林+他唑巴坦、替卡西林+棒酸、復方新諾明、妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素、奈替米星、環丙沙星均耐藥。整合子陰性菌株對頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、環丙沙星、阿莫西林、哌拉西林耐藥。整合子陽性和陰性的鮑曼不動桿菌對6種都耐藥的抗生素(頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、環丙沙星、阿莫西林、哌拉西林)和2種都敏感的抗生素(亞胺培南、美羅培南)差異均無統計學意義。

2.3 產物序列分析 PCR產物經凝膠回收純化后進行測序,實際長度為2 347 bp。經Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)網站BLAST比對后,在 I類整合子可變區共有3個耐藥基因盒:aaeA4、catB8和aadA1,其中aaeA4,aadA1導致鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類的耐藥,catB8則導致了其對氯霉素的耐藥性。

3 討論

鮑曼不動桿菌是造成院內感染的重要條件致病菌,廣泛存在于自然界和人體表面。氨基糖苷類藥物與β內酰胺類藥物聯合用藥曾是治療鮑曼不動桿菌感染的有效藥物。但是近年來隨著抗生素的大量使用或濫用,鮑曼不動桿菌的耐藥率逐步上升[1],甚至出現了對Gram陰性桿菌抗菌譜藥物全部耐藥的菌株,稱為泛耐藥鮑曼不動桿菌,成為醫院感染的一種重要的病原菌[2]。近年來臨床分離的鮑曼不動桿菌對頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類常用抗菌藥物出現多重耐藥性.甚至對碳青烯霉類藥物也出現耐藥,致嚴重的院內感染,給臨床治療帶來極大困難。

鮑曼不動桿菌的耐藥機制非常復雜,包括產生多種β內酰胺酶、氨基糖苷類藥物修飾酶、外膜蛋白丟失、青霉素結合蛋白改變和泵出等[9]。在耐藥鮑曼不動桿菌中檢測到的多數耐藥基因常位于整合子基因盒中。整合子是細菌基因組中的可移動遺傳物質,攜帶位點特異性重組系統組分,可將許多耐藥基因整合在一起,從而形成多重耐藥[3]。整合子共分為6類,其中I類整合子分布最為廣泛,在桿菌的耐藥機制中扮演著非常重要的角色。I類整合子的可變區域中常常攜帶有重要的抗性基因.包括氨基糖苷類修飾酶基因、金屬酶基因和超廣譜的β內酰胺酶基因等,通過對 I類整合子基因盒中攜帶的外源基因的檢測,使我們有可能更深入地了解鮑曼不動桿菌的耐藥機制。

表1 I類整合子陽性與陰性鮑曼不動桿菌耐藥率比較

我們對I類整合子可變區的序列進行分析后發現,整合子中包括1個aacA4,catB8和1個aadA1的基因盒。其中aaeA4,aadA1導致鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類的耐藥,catB8編碼對氯霉素的耐藥性。但同時我們也看到,I類整合子陰性的鮑曼不動桿菌對許多抗生素也表現出了較強的耐藥性,這些結果表明,除了I類整合子外,我院鮑曼不動桿菌發生多重耐藥可能還與其它耐藥機制有關。研究臨床鮑曼不動桿菌的耐藥機制,加深對細菌多重耐藥的發生和轉移機制的了解,有助于做好細菌耐藥性的控制工作。同時更重要的是加強臨床細菌耐藥性發生和發展的監控,合理使用抗菌藥物,延緩細菌耐藥性的產生。

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