順鉑誘導人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP細胞內質網應激差異的研究

周 彤,于慧美,蘇 靜,鄭向雨,徐 冶,2,孫連坤*

（1.吉林大學a.08級臨床醫學五年制;b.白求恩醫學院病理生理學系,吉林長春 130021;2.吉林醫藥學院組織學與胚胎學教研室）

卵巢癌是女性生殖器官常見惡性腫瘤之一,死亡率卻居婦科惡性腫瘤首位[1]。術后常規治療方案是在細胞減滅術的基礎上進行以順鉑為主的聯合化療。順鉑是廣泛使用的化療藥物,但由于原發或繼發的多藥耐藥的存在,嚴重影響了化療的療效及患者預后[2,3]。已有研究表明,細胞順鉑耐藥的形成與內質網應激有關[4,5]。順鉑能誘導細胞內形成大量泛素化的未折疊及錯誤折疊蛋白,而細胞內絕大部分聚集蛋白和大部分可溶性蛋白通過自噬途徑清除[6,7]。如果細胞內堆積的錯誤折疊蛋白不能及時清除,就會引發細胞發生內質網應激介導的凋亡。本實驗通過比較順鉑誘導人卵巢癌細胞SKOV3和SKOV3/DDP內質網應激的差異,進而探討SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥的機制,希望為人卵巢癌的臨床治療提供新的理論基礎和實踐依據。

1 材料和方法

1.1 材料

人卵巢癌細胞株SKOV3和SKOV3/DDP購買自中國科學院和北京協和醫院;RT-PCR試劑盒、限制性內切酶 、DL2000（TaKaRa）;胎牛血清 、Trizol 、RMPI-1640培養基（Invitrogen）;T4 DNA連接酶、反轉錄試劑盒（Promega）;質粒小抽試劑盒（Takara）;細胞裂解液（碧云天）;IRE-1α抗體（santa cruz）;PERK抗體（santa cruz）;β-actin 抗體（santa cruz）;XBP-1引物合成（上海生工生物技術有限公司）,其它試劑為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SKOV3和SKOV3/DDP細胞均采用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養液培養,兩種細胞均采用0.4%胰酶消化傳代培養。順鉑耐受型細胞株SKOV3/DDP在培養過程中需要加入1μg/ml順鉑,以維持SKOV3/DDP細胞表型及耐藥性。

1.2.2 MTT 細胞按1×104個/孔接種于96孔板,待細胞達到對數生長期,按梯度加入不同濃度的順鉑。培養24 h后,每孔加入20μlMTT,孵育4-6 h后,棄掉培養液,每孔加入150μl的DMSO,充分溶解甲瓚。酶標儀上選取570 nm波長,測定各孔的吸光度值,記錄結果。

1.2.3 XBP-1引物設計及RT-PCR擴增檢測 根據NCBI提供的XBP-1的序列,利用DNAman設計人源的XBP-1引物。XBP-1引物序列為 5′-GAATGAGTGAGCTGGAAC-3′,5′-GGTCCAAGTTGTCCAGAAT-3′。GAPDH引物序列為5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′,5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGT-3′。

順鉑作用兩種細胞不同時間點,用Trizol裂解并提取總RNA,各取5μg RNA經逆轉錄反應成cDNA備用。RT-PCR擴增XBP-1片段。RT-PCR的反應體系為 :sense primer 、antisense primer各為 0.5 μl、2×TaqMaster 10 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 8 μl,總體積為20μ1;反應條件如下:94℃,60 s,55℃,30 s;72℃,60 s,共進行30個循環。

1.2.4 Western Blot 順鉑作用兩種細胞不同時間點后,細胞裂解并提取蛋白,測濃度后取60μg蛋白進行SDS-PAGE電泳,采用BIO-RAD轉移裝置將蛋白轉移至PVDF膜,用5%的脫脂奶粉封閉膜上的非特異結合位點后,分別加入1∶200稀釋的 IRE-1α、PERK、β-actin等抗體孵育過夜后,再分別加入 1∶1 000稀釋的二抗孵育。DAB顯色,凝膠成像系統采集圖像后保存。

2 結果

2.1 MTT法檢測順鉑對人卵巢癌細胞生存率的影響 不同濃度的順鉑分別作用SKOV 3和SKOV3/DDP細胞24 h,檢測順鉑對人卵巢癌細胞生存率的影響。結果顯示,兩種細胞對細胞均表現出時間依賴性和劑量依賴性。順鉑作用24 h,SKOV3細胞的IC50為8.25μg/m l,SKOV3/DDP的IC50為26.13 μg/m l（P＞0.05,n=3）（見圖1）。

2.2 Western b lot檢測內質網應激相關蛋白表達順鉑（6μg/ml）分別作用SKOV3和SKOV3/DDP細胞0 h、12 h、24 h,收集細胞,提取細胞總蛋白。Western blot分析兩種細胞在順鉑作用不同時間點IRE-1α、PERK蛋白的表達情況。結果顯示,順鉑明顯激活SKOV3細胞中的內質網應激相關蛋白表達（P＜0.01,n=3）,而對SKOV3/DDP細胞中相關蛋白表達沒有明顯影響（P＞0.05,n=3）（見圖2）。

圖1 順鉑對SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響（*P＜0.05,n=3）

圖2 順鉑對SKOV3和SKOV3/DDP細胞內質網應激相關蛋白表達的影響（**P＜0.01,n=3）

2.3 RT-PCR檢測XBP-1mRNA表達 順鉑分別作用SKOV3和 SKOV3/DDP 細胞0 h、12 h、24 h,收集細胞,提取細胞總RNA。RT-PCR分析,結果顯示順鉑誘導SKOV3和SKOV3/DDP細胞中XBP-1基因表達,但是SKOV3/DDP細胞中XBP-1基因上調更明顯（P＜0.01,n=3）（見圖3）。

3 討論

據統計全球每年有4%的女性惡性腫瘤患者死于卵巢癌[8],目前術后常規治療方案是在細胞減滅術的基礎上聯合應用順鉑為主的化療的綜合治療。順鉑是廣泛使用的一線化療藥物,以順鉑為主的聯合化療已在卵巢癌、頭頸部腫瘤和肺癌中卓見成效。

圖3 順鉑對SKOV3和SKOV3/DDP細胞XBP-1基因表達的影響（**P＜0.01,n=3）

雖然目前順鉑耐藥的機制還不是很清楚,但是已明確這涉及到多方面因素,包括:①細胞通過阻礙順鉑與DNA結合;②增強解毒性;③提高DNA的修復;④調節轉運蛋白的表達;⑤激活促細胞存活的一系列基因的表達,如 Bcl-2,Erk-1/2和 NF-kB等[9,10]。最近的研究表明順鉑能夠誘導細胞內形成錯誤折疊蛋白積累,從而誘發內質網應激,最終導致細胞凋亡的發生。許多生理和病理情況,如缺氧、內質網Ca2+耗竭、氧化損傷、高脂飲食、低血糖、病毒感染等均可能導致內質網蛋白折疊負荷能力的失衡,導致未折疊蛋白在內質網內的堆積,即發生內質網應激[11]。當細胞處于內質網應激狀態時,可以激活細胞內的信號傳導系統和相關的降解途徑,清除細胞內積累的錯誤折疊的蛋白,減弱細胞應激水平,但是當內質網損傷的程度持續加重不能被恢復時,內質網應激可以導致細胞死亡。

我們的研究發現,SKOV3和SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性存在顯著差異。順鉑（6μg/ml）可以誘導SKOV3細胞發生內質網應激,并導致內質網應激介導的細胞凋亡的發生,而同等濃度的順鉑對SKOV3/DDP細胞內質網應激相關蛋白沒有明顯的影響。XBP-1是一種特殊的基因,一般在內質網應激的時候被激活,激活形式的XBP-1能夠抑制細胞內新蛋白的合成,緩解內質網加工修飾蛋白的壓力。在我們的結果中,順鉑明顯激活SKOV3細胞中內質網應激蛋白表達;與SKOV3細胞相比,SKOV3/DDP細胞中內質網應激相關蛋白水平很低,順鉑對內質網應激相關蛋白誘導表達不明顯,但能顯著提高XBP-1基因表達。由此本研究提出內質網應激信號通路在腫瘤化療耐藥機制中可能具有重要作用,可能為臨床腫瘤治療研究提供新的思路。

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