實驗性糖尿病大鼠結狀神經節超微結構形態學的改變及bFGF表達的改變

高 尚,丁麗宏,汪劍威,圖門烏力吉*

（1.內蒙古醫學院,內蒙古 呼和浩特 010051;2.內蒙古醫學院附屬醫院）

糖尿病神經病變（DNP）是糖尿病最常見的并發癥以及是病人致殘的主要原因之一,嚴重影響患者的生活質量和生命健康[1]。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）,能促進體外培養大鼠海馬、皮層隔、丘腦神經元的存活和突起的生長,以及脊髓神經元（雞胚）的存活[2,3]。在病理情況下細胞因子的異常表達多與系統或器官疾病的產生、發展密切相關。本實驗通過對糖尿病大鼠結狀神經節形態結構的觀察,檢測結狀神經節中bFGF的表達,探討細胞因子bFGF對糖尿病周圍神經系統功能障礙的發生、發展的影響,為糖尿病周圍神經系統功能障礙的發病機制和治療提供一定的形態學理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型及分組

選用雄性健康SD大鼠25只,體重160 g-180 g,隨機分為2組,對照組10只,模型組15只。用0.1M pH=6.0枸櫞酸鹽緩沖液,將脲佐菌素配成2%新鮮脲佐菌素（STZ）溶液,濾菌器除菌,以60mg/kg劑量一次性腹腔注射。正常對照組用等量生理鹽水腹腔注射。選擇注射STZ后72 h尾靜脈取血測血糖,血糖≥16.7mmol/l,尿量以及飲水量明顯增多者列入糖尿病實驗大鼠模型,本組有13只造模成功。期間動物統一籠養,喂以基礎飼料,自由進水,不進行胰島素注射治療,每兩周測體重和血糖。

1.2 標本收集及檢測方法

飼養8周后所有的大鼠稱取體重,均禁食水10小時,尾靜脈取血測血糖。動物處死前5%烏拉坦腹腔注射麻醉（1.0ml/100 g體重）。在頸部正中線處,作4 cm切口,借助手術顯微鏡,找出左右側頸動脈鞘,并仔細分離出迷走神經,至顱底頸靜脈孔即迷走神經離開顱腔處,立即取左側結狀神經節制備電鏡標本,右側結狀神經節固定于4%多聚甲醛中固定,常規脫水、石蠟包埋、切片,采用免疫組化染色,觀察結狀神經節bFGF表達（bFGF試劑盒購于Sigma公司）。細胞質內見染成棕黃色顆粒的結狀神經節細胞,認定為表達陽性細胞。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統,在400倍視野下每張切片取5個視野,測定平均灰度值作半定量分析,用以反映其蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 實驗組大鼠注射藥物后,整體狀態差糖尿病大鼠組較正常對照組明顯開始消瘦,大鼠出現多尿、多飲、多食癥狀,行動遲緩,精神萎靡不振、體毛發黃、稀疏、掉毛,反應遲緩等癥狀,血糖值與正常對照組比較維持在（＞16.7 mmol/l）水平（體重及血糖見表1和表2）。

表1 對照組與糖尿病組體重（克）值比較

表2 對照組與糖尿病組血糖值（mmol/L）比較

2.2 結狀神經節電鏡結果

電子顯微鏡下正常對照組大鼠的細胞核,呈規則的圓形或橢圓形,核內顆粒均勻一致,核仁清晰可見,著色深。細胞質內有大量的細胞器:大量的尼氏體（合成蛋白質的場所）;線粒體數量較多,呈圓形或橢圓形,嵴呈板狀或管狀,基質內顆粒較少;高爾基復合體比較發達,常由扁平囊、光滑小泡、有衣小泡和大泡組成;高爾基復合體附近有很多的溶酶體;可見有大小不等的,形狀不規則的脂褐素顆粒（圖1）。糖尿病大鼠組的細胞核不規則,有偽足伸出,核仁可見。細胞質內細胞器減少:膜較清楚,腫脹變性,嵴斷裂、溶解,內部結構不清;內質網腫脹,核糖體有脫落現象;高爾基復合體成熟面腫脹;神經原纖維數量增多,腫脹,體積增大（圖2）。

2.3 免疫組化結果

細胞質內見染成棕黃色顆粒的結狀神經節細胞,認定為表達陽性細胞。對照組大鼠結狀神經節細胞胞漿內有散在的黃褐色顆粒,呈弱陽性反應;糖尿病大鼠組結狀神經節細胞胞漿內出現黃褐色塊狀物質,呈強陽性反應（圖4）。bFGF平均積分光密度值（IDP）測定見表3。

圖1 正常對照組

圖2 糖尿病組

表3 對照組與糖尿病組bFGF的IDP值比較

圖3 正常對照組

圖4 糖尿病組

3 討論

本文采用免疫組化的方法觀察了大鼠結狀神經節中神經元bFGF的表達以及分布情況。結果表明糖尿病組和正常對照組結狀神經節神經元胞漿中都有bFGF的表達,但糖尿病大鼠組表達強度明顯高于正常對照組（P＜0.01）;電子顯微鏡顯示糖尿病大鼠節狀神經節的神經元有損傷表現,說明bFGF在糖尿病大鼠節狀神經節的神經元中高表達,可能對神經元營養以及再生有作用。

神經生長因子（NGF）是交感神經元、感覺神經元和中樞神經膽堿能神經元神經元生長、發育、存活、維持功能所必須的營養因子[4]。NGF對效應神經元的作用主要有:①影響效應神經元的發育、分化過程;②維持成熟效應神經元正常功能;③參與成年動物效應神經元損傷后的修復與再生[5]。在神經系統發育早期,bFGF參與神經元前體細胞增殖和最初分化,并起到級聯控制過程。在神經祖細胞發育成神經元的過程中,首先受bFGF的作用,誘導NGF受體的表達,并使細胞存活依賴于NGF。本實驗也發現,糖尿病神經病變時,確實存在神經元的損傷。而糖尿病神經病變時,大多數實驗研究發現NGF的水平是下調的,原因是NGF的生成是減少的以及NGF受體的功能是異常的[6]。因此我們是否可以推測,bFGF表達增強可能是因為NGF的水平是下調導致的。

BFGF及其受體在周圍神經的表達和損傷后變化的研究說明,與在中樞神經系統內,內源性bFGF表達增多同樣是外周神經損傷后的早期反應[11]。有些學者將bFGF應用于神經細胞的培養和神經損傷模型等實驗,發現bFGF具有廣泛的促神經再生作用,提示bFGF表達增多是神經損傷后的修復反應,且可能具有始動意義。而對于動物實驗,現在大部分學者集中于對神經干的研究,本實驗從神經元的角度,利用bFGF在神經細胞內的表達強弱,探討了糖尿病時神經病變,為糖尿病神經病變的機制提供形態學依據。同時,是否可根據bFGF在神經元細胞內表達程度的高低,來判斷糖尿病中神經元損傷程度,進一步判斷糖尿病神經病變范圍,有待探討。

本實驗結狀神經節位于迷走神經干上的一個膨大,其中的神經元為假單極神經元,周圍突組成迷走神經中的感覺纖維成分,主要分布于頭、頸、胸、腹腔臟器;中樞突向腦投射。本實驗從神經元的水平探討了糖尿病神經病變的機制,那么神經元的損傷是否會引起神經干及其相連的效應器或感受器的損傷,還是在糖尿病時,三者是互相影響的,需要進一步探討。

BFGF作為一種具有廣泛生物學活性的生長因子和神經營養因子,隨著bFGF研究的深入,可能給糖尿病神經病變的發病機制提出新的問題,給治療帶來新的希望。

[1]杜文和,李芝應,林 平,等.糖尿病神經病變發病的研究進展[J].重慶醫學,2010,39（2）:241.

[2]Zamburlin P,GilardinoA,A rianoP,et al.GDNF and bFGF are differentially involved in glial celldifferentiation and neurite bundle formation in cultures from chick embryonic ciliary ganglia[J].Neuroreport,2003,（18）:2343.

[3]TimmerM,Cesnulevicuius K,Winkler C,et al.Fibroblast growth factor（FGF）-2 and FGF receptor 3 are required for the development of the substantia nigra,and FGF-2 plays a crucial role for the rescue of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopam ine lesion[J].JNeurosci,2007,（3）:459.

[4]孫小單,李羽佳.神經生長因子促神經再生作用的研究進展[J].遼寧醫學院學報,2010,31（4）:377.

[5]張海明,張 映.神經生長因子對神經元作用的研究進展[J].動物醫學進展,2006,27（9）:39.

[6]Ali TK,Matragoon S,Pillai BA,et al.Peroxynitritemediates retinal neurodegeneration by inhibiting nerve growth factor survival signaling in experimentaland human diabetes[J].2008,57（4）:889.

[7]陸錦標,劉 穎,葉諸榕,等.外源性堿性成纖維細胞生長因子對缺血大鼠腦內源性堿性成纖維細胞生長因子表達的影響[J].中國神經科學雜志,2004,20（4）:290.