12-脂氧化酶基因敲除對(duì)1型糖尿病腎病小鼠腎小球內(nèi)纖維連接蛋白表達(dá)的影響

李龍鎬,陳 志,孫珉丹,尹 悅,李 佳,王婉寧,臧崇森,許鐘鎬*

眾多實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病腎病（Diabetic nephropathy,DN）等嚴(yán)重影響人類健康的疾病與白細(xì)胞型12-脂氧化酶（12-lipoxygenase,12-LO）的表達(dá)增加有密切的關(guān)系[1-4]。12-LO的激活在腎病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[1,2]。腎臟細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix,ECM）堆積是DN的特征性病變。早期研究證實(shí)了DN時(shí)12-LO主要通過介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)通路—MAPK信號(hào)通路的一個(gè)途徑—p38 MAPK信號(hào)通路引起ECM堆積,而另外兩個(gè)MAPK信號(hào)通路—ERK和JNK信號(hào)通路無此介導(dǎo)作用[5-7]。然而,12-LO能否直接參與DN時(shí)腎小球細(xì)胞肥大過程,目前還不清楚。很多研究已明確纖維連接蛋白（Fibronectin,FN）是DN時(shí)腎小球肥大的標(biāo)志性蛋白。本研究首次探討1型DN時(shí)12-LO基因敲除對(duì)腎小球內(nèi)FN表達(dá)的影響,為12-LO在DN時(shí)腎小球纖維化過程中的作用提供最直接的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 FN,β-actin抗體（美國Santa Cruz公司）,RNA STAT-60試劑（美國 Tel-Test Inc）,RT-PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶和dNTP（德國 Boehringer Mannheim GmbH）,18S引物（美國Ambion Inc.）,免疫組織化學(xué)試劑盒（美國Dako Corporation）。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 體重為22-25g的野生型和12-LO基因敲除C57BL/6小鼠（美國Jackson Laboratories）隨機(jī)分成4組:野生型對(duì)照組（n=8;WT）;12-LO基因敲除組（n=8;LOKO）;野生型糖尿病組（n=8;WT+STZ）;12-LO基因敲除糖尿病組（n=8;LOKO+STZ）。小鼠禁食12小時(shí)。模型組小鼠一次性腹腔注射STZ（200mg/kg,溶于pH4.2,0.1mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液,冰浴新鮮配制）,48小時(shí)后經(jīng)小鼠尾靜脈采血測(cè)血糖,以隨機(jī)血糖高于300mg/dL為糖尿病模型成功。對(duì)照組注射等量的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。16周后處死動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前留取24小時(shí)尿,測(cè)血糖、稱重,乙醚麻醉小鼠,心臟取血,取出右腎稱重,采用系列過篩方法分離腎小球,在-70℃保管。

1.3 RT-PCR 取凍存的腎小球,用RNA STAT-60試劑一步法提取腎小球的總RNA。用RT-PCR試劑盒合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系包括1μg總RNA、10×PCR buffer,1 mmol/L dNTP,5mmol/L Mgcl2,0.5μg oligo（dT）,15U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶,20U RNA酶抑制劑。反應(yīng)條件為30℃10分種,42℃30分種,99℃5分種,5℃5分種。小鼠FN引物序列為:正鏈5′-GCACAACAGACCACCAAACTCG-3′, 反 鏈 5′-CTGAAGTCACTTCTCGGGGTGCG-3′,擴(kuò)增片段大小 430 bp。PCR反應(yīng)條件:95℃,預(yù)變性3分種,循環(huán)條件:94℃變性30秒,56℃退火30秒,72℃延伸1分種,循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7分種,進(jìn)行循環(huán)35次。最后各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠（含0.5mg/L溴化乙錠）中電泳,于紫外線燈下拍照。為了半定量PCR產(chǎn)物,將膠片上反應(yīng)條帶在圖像分析儀中掃描。

1.4 免疫組織化學(xué)檢查 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化;1%H2O2作用15分鐘,PBS洗;0.05%胰蛋白酶液37℃作用30分鐘,PBS洗;10%正常山羊血清孵育15分種抑制非特異性結(jié)合;滴加FN一抗,4℃過夜,PBS洗;滴加二抗（生物素化兔抗鼠IgG）,37℃孵育30分鐘,PBS洗;滴加復(fù)合物（鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液）,37℃孵育30分鐘;DAB顯色,水洗后用蘇木素復(fù)染,透明封片。每批均設(shè)有陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物的一般情況分析 與野生型對(duì)照組比較,野生型1型糖尿病小鼠血糖（P＜0.01）、腎重/體重比值（P＜0.01）和24小時(shí)尿白蛋白明顯增高（P＜0.01）,但12-LO基因敲除糖尿病小鼠尿白蛋白（P＜0.05）、腎重/體重比值（P＜0.05）明顯低于野生型糖尿病小鼠,見圖1。

圖1 各組小鼠血糖、腎重/體重比值及24小時(shí)尿白蛋白的變化

2.2 RT-PCR結(jié)果分析 基礎(chǔ)情況下,野生型和12-LO基因敲除小鼠腎小球FN mRNA表達(dá)無差異。與野生型對(duì)照組相比,野生型糖尿病小鼠腎小球FN mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.01）,但12-LO基因敲除可阻止糖尿病小鼠腎小球FNmRNA表達(dá)的增加（P＜0.05）,見圖 2。

2.3 免疫組織化學(xué)檢查分析 基礎(chǔ)情況下,野生型和12-LO基因敲除小鼠腎小球FN蛋白表達(dá)無差異。與野生型對(duì)照組相比,野生型糖尿病小鼠腎小球FN蛋白表達(dá)明顯增加,但12-LO基因敲除可阻止糖尿病小鼠腎小球FN蛋白表達(dá)的增加,見圖3。

3 討論

圖2 各組小鼠腎小球內(nèi)FN mRNA表達(dá)的變化

圖3 各組小鼠腎小球FN免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果（×400）

12-LO是一種不飽和脂肪酸的氧合酶,它以花生四烯酸為基質(zhì)生成相應(yīng)的氫氧化二十碳四烯酸12-HETE。目前研究已證實(shí)12-LO及其代謝產(chǎn)物主要通過氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)參與多種疾病的病理過程,如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、DN等[1-4]。近期的研究已明確12-LO、TGF-β和AngⅡ之間存在著相互協(xié)同作用[5-7]。12-LO通過p38MAPK信號(hào)通路引起腎小球ECM積聚,其作用在關(guān)于DN發(fā)病機(jī)制的研究中得到一些證實(shí)[5-7]。然而,12-LO是否直接參與DN時(shí)腎臟肥大及腎小球ECM積聚,目前尚無相關(guān)報(bào)道。

眾所周知,高糖在DN的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵的作用。高糖是引起糖尿病合并癥的導(dǎo)火線。美國的1441例1型糖尿病病人的DCCT的前瞻性研究和英國對(duì)2型糖尿病的UKPDS研究明確地提出,嚴(yán)格控制血糖至接近正常水平可以有效地延緩DN的發(fā)生。Bleich和Han等的研究為糖尿病時(shí)抑制12-LO來保護(hù)胰腺β細(xì)胞而延緩血糖升高的設(shè)想提供了線索,其依據(jù)為:1）12-LO的代謝產(chǎn)物12-HETE破壞胰島β細(xì)胞的正常功能而降低胰島素的分泌[4];2）一些細(xì)胞因子通過12-LO的介導(dǎo)而破壞胰島β細(xì)胞的功能[4];3）COX-2的代謝產(chǎn)物—前列腺素破壞胰腺β細(xì)胞的功能,抑制12-LO可以減弱COX-2的表達(dá),進(jìn)而減少前列腺素的合成,從而阻止胰腺β細(xì)胞發(fā)生功能障礙[8];4）STZ誘導(dǎo)糖尿病的12-LO基因敲除的小鼠,其血糖在模型成功后一個(gè)月內(nèi)明顯低于野生型糖尿病小鼠[3]。我們的研究發(fā)現(xiàn),用STZ誘導(dǎo)糖尿病的12-LO基因敲除的小鼠,其血糖在模型成功后16周時(shí)仍低于野生型糖尿病小鼠,但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異。我們的結(jié)果證實(shí)通過抑制12-LO的活性可以阻止胰腺β細(xì)胞發(fā)生功能障礙而延緩血糖升高。

DN主要病理特征是腎小球細(xì)胞肥大、ECM堆積進(jìn)而發(fā)生腎小球硬化。在本研究中,為了證明12-LO是否直接參與DN時(shí)腎臟肥大及腎小球ECM積聚,我們采用了12-LO基因敲除小鼠?；蚯贸∈蠹夹g(shù)的建立和發(fā)展使得科學(xué)家們能夠從分子、細(xì)胞及動(dòng)物整體水平研究特定基因在生物發(fā)育、生理以及病理中的作用,對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展具有革命性的意義,對(duì)臨床疾病的認(rèn)識(shí)和治療也起到了關(guān)鍵的推動(dòng)作用。腎小球ECM的主要成分為IV型膠原、層粘連蛋白和FN。很多研究已明確FN是DN時(shí)腎小球肥大和ECM積聚的標(biāo)志性蛋白。我們的研究證實(shí),與對(duì)照組比較,糖尿病小鼠的腎重/體重比值明顯增高,但12-LO基因敲除糖尿病小鼠腎重/體重比值明顯低于野生型糖尿病小鼠,從而證明12-LO直接參與DN時(shí)腎臟肥大。病理學(xué)檢查和RT-PCR結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,野生型糖尿病小鼠腎小球內(nèi)FN明顯增加,但12-LO基因敲除可直接阻止糖尿病小鼠腎小球內(nèi)FN表達(dá)的增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1型糖尿病小鼠腎小球內(nèi)FN增加與蛋白尿的增加同步,但12-LO基因敲除可阻止糖尿病小鼠腎小球內(nèi)FN增加與蛋白尿進(jìn)展?？傊?12-LO可直接誘導(dǎo)腎小球內(nèi)FN的表達(dá)上調(diào),加速DN腎小球肥大及DN的進(jìn)展。因此,通過抑制12-LO來阻止糖尿病腎小球內(nèi)FN的表達(dá)對(duì)延緩DN的進(jìn)展具有重要的意義。

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