P53基因在電離輻射誘導的非小細胞肺癌細胞死亡中的作用

喬 俊,馬淑梅,李英普,宋志恒,易賀慶,侯吉光,賈立立,譚哲峰,劉曉冬*,王鐵君*

（1.吉林大學第二醫院 腫瘤放療科,吉林 長春 130021;2.吉林大學公共衛生學院衛生部放射生物學重點實驗室,吉林長春 130021;3.吉林大學中日聯誼醫院 骨科,吉林 長春 130021;4.吉林省大唐長山電廠職工醫院,吉林 松原 138000）

自噬（autophagy）是細胞通過溶酶體來降解和消化自身受損、衰老以及喪失功能的蛋白、細胞器和部分細胞質等生物分子的過程。自噬過程是真核細胞特有的,為細胞的再生與修復提供原料,實現細胞的再循環與再利用[1]。但自噬在腫瘤中起保護還是抑制作用還不明確,腫瘤在電離輻射誘導下是以自噬為主還是凋亡為主還有待研究。近年研究表明P53與自噬與凋亡都有關系。P53在正常細胞是短壽命的,含量極少,但在哺乳動物細胞應激反應時起主要作用,通過調控細胞周期,DNA損傷的修復,衰老,血管生成和細胞凋亡的基因轉錄活性而發揮作用[2]。近來研究表明,P53也對Caveolin-1,TSAP6,CHmp4C,和DRAM產生影響從而對自噬發揮作用[3]自噬被PI3K嚴格調控,哺乳動物的自噬過程通常被認為PI3KⅠ通過激活Akt-mTOR激酶抑制自噬,而PI3KⅢ通過調節P-tdIns（3）P促進自噬,但是缺乏PI3KⅠ調節自噬的直接證據[4]。有關文獻報道,Akt的激活可以有效的促進MDM2入核,從而與P53相互作用而抑制P53的轉錄活性[2]。最近研究發現MDM2蛋白是P53主要的負向調節蛋白,抑制P53-MDM2交聯可以在結構與生物水平有效激活P53[5]。本研究通過對電離輻射后不同P53狀態的H1299細胞的自噬、凋亡相關蛋白的變化,來探討P53在電離輻射誘導非小細胞肺癌細胞死亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 試劑:AKT、GAPDH、發光試劑盒（ECL）等均購自美國Santa Cruz公司,MDM 2購自Millpore公司,兔抗LC3購自cell signaling公司;二抗羊抗鼠購自中山金橋公司,二抗羊抗兔購自博士德公司。

1.2 細胞培養與照射 人類肺腺癌細胞株（H1299）由本實驗室保存,使用10%胎牛血清的DMEM培養基,37°C、5%CO2培養箱中培養,0.25%胰酶消化傳代。照射條件:美國VARIAN 3000ix醫用直線加速器,單次照射源皮距100cm,吸收劑量率3Gy/min,照射劑量分為0、4、8Gy。

1.3 H1299-P53和H1299-175H細胞模型的建立質粒PcDNA3.1-175H/PcDNA 3.1-p53為本課題組構建并保存,轉入 H1299細胞,分別加800 g·L-1/950μg/m lG418篩選,2周后G418耐藥性克隆形成,標記H1299-175H/H1299-P53細胞。

1.4 流式細胞術檢測凋亡 將處理組細胞用不含EDTA的胰酶消化置于離心管中1 500 r/min離心5 min,棄上清,加入 1×PBS,1 500 r/m in,5min洗兩次。將細胞按1×105/ml密度加入400μl loading buffer置于流式管中,后加入Annexin V/PI各 5μl,4℃避光30min后用流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.5 免疫印跡 細胞加入50-200μl的細胞裂解液（Tris-HCI,NaCL,Triton X100）。4℃,12 000 r/m in離心5min。收集上清,定量后分裝于-70℃冰箱保存。蛋白煮沸5 min進行變性,SDS-PAGE電泳。電泳后濕式轉印NC膜上（100V 90min）;5%脫脂奶粉封閉1.5 h,加1∶1 000稀釋的一抗于4℃搖床過夜;TBS洗膜3次;加1∶1 000稀釋二抗反應90 min,TBS洗膜3次,ECL顯色并記錄結果。

1.6 統計學處理 LC3,AKT,MDM 2,Caspase-3,GAPDH基因與蛋白檢測結果采用Quantity One軟件進行電泳條帶灰度分析。

2 結果

2.1 H1299-P53,H1299-175H細胞模型檢測

將構建的H1299-P53,H1299-175H細胞及實驗室保存的H1299細胞提取總蛋白,采用western bolt檢測轉染P53基因及Psuper-175H突變子的H 1299是否成功,經western bolt檢測,在相對分子量53 KB的位置檢測到蛋白表達,證明構建成功.由于P53是短壽命蛋白,檢測到微量表達。（見圖1）

圖1 P53基因檢測結果

2.2 P53基因對細胞凋亡的影響

采用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡率,H1299,H1299-P53,H1299-175H分別經過電離輻射0GY,4GY,8GY,照射后16小時后進行流式細胞儀檢測,結果如圖2所示結果顯示,H1299（P53-/-）細胞凋亡率隨著照射劑量的增加而降低,而H1299-P53、H1299-175隨著照射劑量的增加而增加,H1299-P53凋亡增加顯著。

2.3 照射后 LC3,Ak t1,MDM 2,Caspase-3蛋白的變化

采用western bolt方法檢測AKT1,Caspase-3,MDM 2,LC3的變化,如圖3所示,灰度分析顯示,LC3在H1299呈現劑量正向依賴性,在H1299-175H呈現劑量負向依賴性,在H1299-P53中,0GY表達最高,4 GY表達最低,8GY表達低于假照組但比4GY高。AKT在H1299細胞隨著照射劑量的增加表達逐漸降低,在H1299-P53在4 GY表達量升高而在8 GY又降低,在H1299-175H細胞中AKT隨著照射劑量的增加表達逐漸降低。MDM 2在H 1299的表達呈劑量正向依賴性,在H 1299-P53細胞中呈現與AKT相同的變化趨勢,在H 1299-175H細胞中4 GY時表達量最高8GY最低。Caspase-3在H1299細胞中隨著照射劑量的增加變化不明顯,在H1299-P53細胞中呈現劑量正向依賴性,在H1299-175H細胞中,0GY表達最高,4GY表達最低,8GY低于假照組但高于4 GY組。

圖2 照射后細胞流式分析結果

圖3 W estern bolt檢測凋亡白噬相關蛋白結果

3 討論

目前,肺癌已經成為導致人類死亡的第二位癌癥[6]。放療是臨床上常用的肺癌治療手段,但是目前常用的放療方案難以完全殺滅腫瘤細胞,能否運用放射治療與特定靶點基因聯合治療就成為當前研究熱點。

流式細胞術檢測細胞凋亡率顯示,在H1299（P53-/-）細胞中,照射后凋亡率降低,結果提示電離輻射誘導H1299（P53-/-）的死亡方式不是以凋亡為主。在H1299-P53、H1299-175H細胞中,細胞凋亡率隨著劑量增加而增加,H1299-P53凋亡率增加更顯著,結果說明P53基因促進細胞發生凋亡。

我們進一步檢測自噬相關基因及凋亡相關基因在相同電離輻射條件下的蛋白表達情況。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達是自噬的特異性指標,LC3的表達強度與自噬活性密切相關[7]。在H 1299細胞中,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值隨著照射劑量的增加而升高,表明自噬在照射后升高。而H1299-P53細胞中4GY照射組相對于假照組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,8GY照射組相對于4GY照組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,表明自噬在照射后降低,說明 P53抑制自噬的發生。在H1299-175H,4 GY照射組相對于假照組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,8GY照射組相對于4GY照組LLC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也降低,提示P53基因在電離輻射誘導下抑制細胞發生自噬。而三組假照組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ依次升高提示P53基因在沒有電離輻射條件下促進細胞發生自噬。

Akt是一個PI3KI下游重要的靶激酶,具有絲-蘇氨酸激酶活性Akt的活化可以調節細胞內蛋白的各項功能,包括促進細胞轉錄與增殖、加強細胞的能動性/粘附性、細胞周期進程加速、加速腫瘤血管生成使細胞發生惡性轉化[8]。AKT下游有一系列亞基包括FOXO,BAD,MDM 2,TSC2和GSK3,它們來促進細胞增殖、生長與存活[9]。已有文獻證實,電離輻射是通過抑制PI3K/AKT而發生自噬[8]。在H1299中AKT的表達量隨著照射劑量的增加而降低,表明電離輻射抑制了AKT的表達,從而促進自噬的發生。在H1299-P53細胞中AKT表現呈現劑量正向依賴性,而三組假照組細胞的AKT表達依次降低,說明P53在沒有電離輻射條件下抑制AKT的表達促進自噬的發生,三組4GY照射組細胞AKT的變化不顯著。

MDM2維持細胞一系列基本功能的關鍵調節子,也是癌癥治療的很有希望的藥物作用靶點。引起人們對MDM2廣泛的關注是其與腫瘤抑制蛋白P53的關系[10]。MDM2已經被證實是腫瘤抑制子P53的一個負向調控子,主要通過兩種機制:（1）MDM2直接與P53的N末端結合抑制P53的轉錄激活[10];（2）MDM 2的E3泛素連接酶通過26S蛋白酶來修飾及降解P53[11]。在H1299細胞MDM2的表達呈現劑量依賴性升高,在H1299-P53細胞4G表達最高0GY最低,在H1299-175H細胞中4GY表達最高,8GY回落至最低。三組假照細胞H1299-175H細胞MDM 2增加最明顯。4GY照射組依次升高,8GY照射組依次降低。結果提示電離輻射通過激活MDM 2而負向調控P53。

凋亡的特征性指標Caspase-3在H1299細胞中照射后變化不大,說明凋亡不是電離輻射誘導H1299細胞死亡的主要方式。在H1299-P53細胞中,caspase-3呈現劑量正向依賴性,說明p53在電離輻射條件下促進細胞發生自噬.而突變子H1299-175H在照射后凋亡降低,表明突變子已經不具有正常P53的功能。

本課題研究選證實X射線引起H1299 P53（-/-）的死亡主要是以自噬性死亡為主,而引起H1299-P53及H1299-175H的死亡則以凋亡為主,從而為臨床尋求新的治療方案提供理論依據。

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