Sphk-1在人腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)的研究

李 強(qiáng),許海洋,佟 倩,張顯峰*,于洪泉,姜云鵬,張永海

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)外科,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春 130021;3.吉林大學(xué)病理解剖學(xué)教研室,吉林 長(zhǎng)春 130021）

惡性膠質(zhì)瘤是一種高侵襲性,低生存率的顱內(nèi)腫瘤,但對(duì)于其診斷治療手段仍然未取得有效進(jìn)展。由于腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成及侵襲性都是脂質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)事件。所以近年來(lái),脂肪生成/脂質(zhì)代謝在惡性腫瘤研究中已經(jīng)引起越來(lái)越多的學(xué)者的關(guān)注。磷酸鞘氨醇激酶-1（SphK-1）作為一種脂質(zhì)酶,而S1P作為其催化底物,與人類多種癌癥存在著必然的聯(lián)系。國(guó)外研究表明:SphK-1具有強(qiáng)有力的致瘤性和促血管生成作用,在多種癌細(xì)胞中SphK-1 mRNA的表達(dá)皆被上調(diào)。本文采取免疫組化法檢測(cè)SphK-1在正常腦組織和人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率,探討其與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系及作為治療靶點(diǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人Sphk1抗體（濃縮型）,由上海晶天生物有限公司提供;免疫組化試劑盒,由福州邁新有限公司提供;本實(shí)驗(yàn)所使用的10例腦出血患者正常腦組織及人腦膠質(zhì)瘤石蠟組織標(biāo)本62例收集于吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科2008年9月-2010年4月外科手術(shù)中。其中原發(fā)55例,復(fù)發(fā) 7例;男性 35例,女性27例;年齡10-72歲,平均40.50歲。參照2000年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),低級(jí)別膠質(zhì)瘤（Low grade glioma,LGG,Ⅰ、Ⅱ級(jí)）28例,其中包括:星形細(xì)胞瘤12例,混合少突星形細(xì)胞瘤13例,室管膜瘤3例;高級(jí)別膠質(zhì)瘤（High grade glioma,HGG,Ⅲ、Ⅳ級(jí)）34例,其中包括:間變性星形細(xì)胞瘤11例,間變性少突星形細(xì)胞瘤9例,間變性室管膜瘤2例;星形細(xì)胞里Ⅳ級(jí)4例,少突星形細(xì)胞瘤Ⅳ級(jí)3例,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤5例。術(shù)前均未接受放療或化療。

1.2 方法

1.2.1 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)此10例正常腦組織及62例人腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行一系列的石蠟包埋及染色,然后應(yīng)用SphK-1抗體進(jìn)行染色,在高倍顯微鏡下觀察。

1.2.2 結(jié)果分析 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下[1]:SphK-1蛋白染色陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒。在400倍視野下,隨機(jī)選擇10個(gè)視野,計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,分別計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及其表達(dá)率。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞率及染色強(qiáng)度按下述標(biāo)準(zhǔn)分級(jí):①陰性（-）,隨機(jī)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于10%;②弱陽(yáng)性（+）,胞漿內(nèi)均勻分布淺棕褐色反應(yīng),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%-25%;③中等陽(yáng)性（++）,深棕褐色反應(yīng),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%-50%;④強(qiáng)陽(yáng)性（+++）,棕黑色反應(yīng),胞漿內(nèi)呈粗大顆粒或塊狀著色,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)數(shù)據(jù)采集的不同方法及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的不同要求,選用χ2檢驗(yàn)及spearman相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn),使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 10.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 Sphk-1的染色結(jié)果 正常腦組織及21例膠質(zhì)瘤細(xì)胞中未檢測(cè)到Sphk-1的表達(dá),41例腫瘤組織中可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)染色陽(yáng)性,為棕褐色顆粒。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 膠質(zhì)瘤Ⅰ-Ⅱ級(jí)的病理結(jié)果（40×10）

圖2 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的病理結(jié)果（40×10）

2.2 免疫組化染色結(jié)果 本組Sphk-1在膠質(zhì)瘤中的總陽(yáng)性表達(dá)率為66.1%。膠質(zhì)瘤與正常腦組織之間,各組間兩兩比較,應(yīng)用 χ2檢驗(yàn),差異均有顯著性（P＜0.01）,通過(guò)spearman相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn),r=0.748,P＜0.01,表明SphK-1與人腦膠質(zhì)瘤的分級(jí)存在相關(guān)性。Sphk-1蛋白的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別具有相關(guān)性。隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高,Sphk-1蛋白表達(dá)明顯增高。見(jiàn)表1。

表1 SphK-1在人腦正常腦組織及膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

3 討論

膠質(zhì)細(xì)胞瘤為神經(jīng)上皮性腫瘤,約占顱內(nèi)腫瘤的45%,根據(jù)腫瘤細(xì)胞的分化情況可分為:髓母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和室管膜瘤,髓母細(xì)胞瘤[2]。惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤進(jìn)展快,導(dǎo)致其患者的愈后效果較差,相關(guān)報(bào)道認(rèn)為:對(duì)膠質(zhì)瘤的治療多年來(lái)仍然沒(méi)有重大進(jìn)展,其一年生存率僅為30%,并且其總的生存時(shí)間不超過(guò)53周。即使應(yīng)用外科手術(shù)、放化療等多種治療手段效果仍不明顯。如此低的生存率很大程度上與膠質(zhì)瘤的高侵蝕性有密切關(guān)系[3]。

眾所周知,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與細(xì)胞周期失調(diào)控、細(xì)胞異常增殖相關(guān)。最近的研究表明,脂肪生成/脂質(zhì)代謝在癌癥研究中已經(jīng)引學(xué)者的廣泛關(guān)注。首先,脂質(zhì)是細(xì)胞膜的重要組成部分。其次,癌細(xì)胞的增長(zhǎng)迅速,需要消耗大量的能量。再次,參與惡性腫瘤進(jìn)展的重要的生物過(guò)程（如:細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成等）都是脂質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)事件[4]。而磷酸鞘氨醇激酶-1（SphK）作為一種脂質(zhì)酶,與其催化底物S1P,與人類多種癌癥有著著必然的聯(lián)系。研究還發(fā)現(xiàn),在人體多種惡性腫瘤中SphK-1mRNA的表達(dá)皆被上調(diào)[5]。

鞘氨醇激酶-1（sphingosine kinase 1,SphK-1）是一種與細(xì)胞生命活動(dòng)密切相關(guān)的鞘氨醇代謝酶[6],在體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)功能。作為體內(nèi)重要的脂質(zhì)之一,鞘氨醇（sphingosine）可由SphK-1催化成為促生長(zhǎng)因子1-磷酸鞘氨醇（S1P）,也可由神經(jīng)酰胺合成酶催化生成促凋亡因子-神經(jīng)酰胺（ceramide）,S1P/ceramide的平衡是決定細(xì)胞生存或凋亡的重要因素,而SphK-1是調(diào)節(jié)這一平衡的關(guān)鍵酶。SphK-1表達(dá)增加不僅導(dǎo)致S1P水平升高,改變S1P/ceramide的平衡,從而對(duì)抗細(xì)胞凋亡,還能增加細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化的速率,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。同時(shí)S1P還發(fā)揮著第二信使的作用[7]。國(guó)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明[8]:SphK-1的缺失將使細(xì)胞周期停滯,增加促凋亡蛋白Bax在線粒體膜上的積聚,激活細(xì)胞凋亡的胞內(nèi)途徑,從而促使細(xì)胞凋亡。

國(guó)內(nèi)外大量研究表明[9]:SphK-1在乳腺癌、結(jié)腸癌及胃癌等體內(nèi)多種惡性腫瘤中表達(dá)顯著增加。而對(duì)于其在顱內(nèi)腫瘤中表達(dá)的研究卻較少,Nicholas Young[10]等在研究中發(fā)現(xiàn)SphK-1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中顯著表達(dá),進(jìn)而刺激其腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲。DongHoon Lee等[11]、中山大學(xué)的Li Jun等[12]在對(duì)大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)SphK-1在星形細(xì)胞瘤中表達(dá)顯著,并且隨惡性程度的增加而表達(dá)增強(qiáng)。但就SphK-1在各型膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的研究卻沒(méi)有。在本次試驗(yàn)中我們就SphK-1在多種膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn)SphK-1蛋白的表達(dá)主要位于細(xì)胞漿內(nèi),其在膠質(zhì)瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常腦組織,應(yīng)用spearman相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn),P＜0.01,提示SphK-1表達(dá)增強(qiáng)與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。SphK-1在低級(jí)別膠質(zhì)瘤與高級(jí)別膠質(zhì)瘤的表達(dá)有顯著差異性（P＜0.05）,同時(shí)在本次實(shí)驗(yàn)中,我們根據(jù)病理分級(jí)把腫瘤標(biāo)本分為三組,比較各級(jí)別膠質(zhì)瘤中SphK-1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)差異存在顯著性（P＜0.05）。可見(jiàn)SphK-1的表達(dá)隨腫瘤惡性程度的升高而增強(qiáng),推測(cè)SphK-1可能參與了膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。因此,抑制SphK-1的生成可能減緩腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,我們認(rèn)為在膠質(zhì)瘤中SphK-1可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲,增加腫瘤的惡性程度,進(jìn)而降低腫瘤的愈后效果,至于其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。同時(shí)我們考慮針對(duì)SphK-1應(yīng)用基因技術(shù)或抗體免疫反應(yīng)在不久的將來(lái)可能為膠質(zhì)瘤的治療提供新的策略。

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