蛋白質組學技術在高血壓領域的應用

齊連芬，李川潔，胡元會

高血壓病是臨床常見病之一，隨著人類基因組計劃的完成，心血管研究趨向于繪制一幅分子生物學“疾病基因圖譜”。蛋白質組學的應用，將基因分析和病理分析串聯起來［1］，現就蛋白質組學在高血壓領域的應用總結如下。

1 蛋白質組以及蛋白質組學的概念

蛋白質組的概念由澳大利亞Wilkins和Willians于1994年提出，指的是由一個基因組所表達的全部蛋白質。蛋白質廣泛參與細胞的功能及調節，蛋白質組決定細胞乃至組織和器官的表型。不論是處于正常狀態還是急慢性疾病狀態下［2］。

2 蛋白質組學在高血壓病中的研究

目前國內外的研究大多對其發病的機制感興趣，故研究多集中在高血壓模型動物的組織蛋白質組學研究。

2.1 高血壓模型動物心肌組織的研究 劉麗等［3］運用蛋白質組學技術探討腹主動脈縮窄（AAC）高血壓大鼠（SHR）左心室差異蛋白質表達，及其在左室肥厚發生機制中的作用，結果顯示，鑒定的21個蛋白質中，相對于假手術組有14個蛋白質上調，4個蛋白質下調，3個蛋白為AAC組新出現。NCBI數據庫檢索后發現上調蛋白質包括：肌球蛋白輕鏈、心肌A肌動蛋白蛋白原、B肌球蛋白重鏈、3磷酸甘油醛脫氫酶、線粒體核糖體蛋白L15、G蛋白偶聯受體34、酪氨酸蛋白激酶ZAP－70、RIKENcDNA 9030617003、天冬氨酸tRNA合成酶等，下調蛋白為H轉運ATP合成酶、卜三脂酰輔酶A脫氫酶等，兩組蛋白表達差異有統計學意義。由此認為高血壓大鼠心肌中參與糖酵解蛋白、信號轉導通路蛋白、基因表達調控蛋白增加，最終心肌細胞結構蛋白增加導致心肌肥厚。

Jin等［4］運用2－DE技術對SHR大鼠心肌蛋白表達進行了研究，與Wistar大鼠相比有20個差異表達的蛋白質點，其中13個點被證明與SHR大鼠早期與血壓維持高水平及其進展有關，而另外7個在后期高表達，并且這些高表達的蛋白可以被血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）類藥物依那普利和氯沙坦逆轉。

金賢等［5］取4周、20周齡雄性SHR和 WKY大鼠，SHR在血壓未升高時就已存在心肌肥厚。經二維凝膠圖比較共找出27個差異蛋白點，質譜分析鑒定出20個差異蛋白，涉及能量代謝、線粒體氧化磷酸化和氧化應激反應等。

2.2 高血壓模型動物腎臟組織的研究 Thongboonkerd［6］運用2－DE和MALDI－TOF－MS技術研究高血壓大鼠腎臟蛋白質組表達的變化。結果發現腎臟蛋白表達譜在E－H誘導的高血壓組和SH處理組不同，血管舒緩素結合蛋白Kallistatin在各組中均有表達，但僅在長期E－H30表達降低。Kallistatin的減少將導致血管中血管舒張因子總量的減少，從而引起或加重高血壓。α1－抗胰蛋白酶A1AT、腎舒血管素活化的抑制因子在EH30組表達上調，但在血壓正常的SH30組下調。此外，平滑肌收縮素（SMCE，包括肌球蛋白）、房肽素和蛋白質二硫化物異構酶（PDI）在 E－H30組上調，但在 SH30組下調。Kallistatin、A1AT、PDI的一致改變提示舒血管素通路在E－H誘導的高血壓發病機制中起作用。

杜于茜等［7］研究氯沙坦干預SHR大鼠后蛋白表達的變化，兩組凝膠的平均蛋白點數分別為570±48、686±30。氯沙坦干預后有13個蛋白表達發生了顯著變化，表達增強4個，表達降低4個，蛋白點消失5個。對13個差異蛋白點進行質譜分析，鑒定出的7個蛋白質為Heat shock protein（HSP）、Tubulin alpha－1chain、Transthyretinprecursor、Liver regenerationrelated protein LRRG03等。

2.3 高血壓模型動物主動脈的研究 Delbosc等［8］對兩種不同種系的高血壓大鼠的主動脈進行研究，Fischer和Brown Norway（BN）大鼠分別分為對照組和干預組［N（Omega）－nitro－L－arginine methyl ester（L－NAME），一種抗高血壓藥物］，結果顯示BN大鼠干預組血管重構不明顯。運用質譜技術對Fischer大鼠干預組表達有差異的蛋白進行研究，差異蛋白是：ubiquitin，smooth muscle （SM）22alpha，thymosin beta4，and C－terminal fragment of filamin A。

卞玉蘭等［9］以SHR大鼠胸主動脈為研究對象，結果在線性pH3～10范圍內和分子量120kDa以內，SHR的2DE圖分離得到2 338±34個蛋白點，WKY得到2 102±48個蛋白點，總共1 870個點匹配，匹配率約為80%。用軟件對凝膠圖進行分析，選擇有2倍以上差異表達的蛋白點有50個，其中有27個點在SHR中表達豐度比WKY高，有23個點在WKY中表達豐度比SHR高。通過膠內酶解后進行一級質譜，得到20個蛋白點的PMF圖譜用 Mascot軟件搜索NCBI非冗余庫，獲得這些蛋白點的身份，結果總共有10個點經鑒定后具有較可信的結果，其功能主要有4大類：酶蛋白、信號通路蛋白、參與胞質分裂過程的蛋白和其他。

2.4 高血壓模型動物腦血管的研究 李書林等［10］用自發性高血壓卒中型大鼠（SHR/SP）試驗，結果表明，青年組 Wistar大鼠腦血管壁明膠酶A（MMP－2）和明膠酶B（MMP－9）的表達很少，而在SHR/SP組大鼠的血管壁表達較多。自發性高血壓大鼠Ⅳ型膠原酶在血管壁表達的增強，可能是長期高血壓致使血管內皮受到應力的損傷，來自血流的切應力和血液的壓力（法向應力）作用于血管壁，激發炎性介質的瀑布反應有關。這些因子促進平滑肌細胞、內皮細胞等的基質金屬蛋白酶表達。基質金屬蛋白酶分解ECM而破壞基底層，并開放血－腦屏障是腦卒中病情加重的重要因素。老年組大鼠 MMP－2、MMP－9的表達也明顯高于青年組，與高血壓大鼠差異無統計學意義。這可能是老年鼠由于動脈內膜的增厚，引起小動脈中層的慢性缺血缺氧，導致炎癥介質、自由基等的產生增加，從而激活明膠酶，引起一系列病理生理變化。

2.5 高血壓模型動物血清、尿蛋白的研究 Sironi等［11］將三種品系的大鼠［SHR，自發性高血壓易中風大鼠（SHR/SP）、Wist－ar大鼠］應用鹽負荷處理一段時間后，用雙向凝膠電泳等測定血清和尿中的蛋白改變，結果發現，在中風前至少4周SHR/SP血清中就檢測到炎癥反應的標志蛋白，包括高水平的硫抑素（thiostatin），在中風前和鹽負荷處理數周后，SHR/SP尿中就出現一些分泌蛋白（轉鐵蛋白、血紅素結合蛋白、清蛋白、α2－HS糖蛋白、血管舒緩素結合蛋白、α1－抗胰蛋白酶、Gc－球蛋白和轉甲狀腺蛋白），此結果提示，在磁共振成像檢測到腦的異常體征前，不典型的炎癥反應和廣泛的血管滲透性改變就已經發生。

3 蛋白質組學在高血壓中醫證型的研究

“證”是中醫對疾病某一階段的特定病理生理過程的認識，是中醫理論中的基本概念，也是辨證論治體系的基礎。將蛋白質組學方法引入中醫“證”的研究，對中醫證相關蛋白質進行篩選和鑒定，為中醫“證”本質的研究提供新的思路與方法。證的特征與蛋白質組有相似之處，且證候的形成及不同治療方法的治療效果必然有其物質基礎，而這種物質基礎就有可能反映在蛋白質變化水平上。

蕭梅芳等［12］研究15例高血壓病肝陽上亢證患者及15例高血壓腦出血肝陽化風證蛋白表達的差異。結果提示：肝陽上亢證與肝陽化風證有6個相同表達的蛋白質，18個差異表達的蛋白質。鑒定出的蛋白質涉及細胞骨架蛋白、代謝酶類、細胞信號轉導蛋白、抗氧化蛋白、血液蛋白等。電壓依賴性陰離子通道蛋白（VDAC）在肝陽化風組及肝陽上亢組表達下調，提示兩證與氧化應激條件下VDAC下調，啟動細胞凋亡有關。

熊新貴等［13］研究17例高血壓腦出血肝陽化風證患者、10名健康對照、23例高血壓肝陽上亢證患者的血清蛋白質表達譜。3組血清中共有8個蛋白質點呈現差異表達，鑒定出5個蛋白質為：血清淀粉樣前體蛋白，銅藍蛋白，維生素D結合蛋白，載脂蛋白C－Ⅲ和轉鐵蛋白。推測其可能與高血壓腦出血肝陽化風證存在一定相關性，其具體機制還有待進一步研究。

4 蛋白質組學在高血壓中藥治療中的研究

以蛋白質表達為指標，采用蛋白質組相關分析技術及生物信息學等方法，通過比較分析中藥作用前后組織、細胞的蛋白質組，能在分子水平了解中藥的作用靶點及方式、代謝途徑［14］。

張鶯等［15］用平肝潛陽方治療高血壓病肝陽上亢證大鼠，有12個表達差異的蛋白質斑點，鑒定確認的8個。其中異檸檬酸脫氫酶、類固醇合成急性調節蛋白在模型組表達較正常組上調，在治療組重新下調至前水平，實驗發現模型組大鼠腎上腺鐵蛋白輕鏈較正常組明顯下調，經治療后又重新上調至高水平。由此推測平肝潛陽法可以作用于鐵蛋白輕鏈，使其水平提高，從而發揮其抗氧化應激損傷的作用。

趙艷［16］用鎮肝熄風湯治療高血壓腦出血患者20例，選取高血壓腦出血肝陽化風證20例隨機分為兩組，分別予以鎮肝熄風湯對證治療及大定風珠非對證治療，結果顯示，研究共篩選出22個差異表達蛋白質點。高血壓腦出血肝陽化風證，經鎮肝熄風湯對證治療后與健康對照組比較2個蛋白表達下調，1個蛋白缺失，5個蛋白表達與健康人無明顯差異。經質譜鑒定有8個蛋白。由此考慮鎮肝熄風湯通過作用于ApoAI，肽酰－脯氨酰－順反式異構酶A（cyPA），使其水平提高，有效地介導膽固醇和磷脂從人主動脈平滑肌細胞的流出從而發揮降壓降脂作用。

5 展 望

蛋白質組研究在心血管疾病中應用越來越廣泛，目前主要受限于敏感性、特異性和高通量［17］。目前中醫證候及中醫藥的蛋白質組學研究尚缺乏公認的標準，研究結果僅限于蛋白質定性，采用不同的檢測技術，蛋白定量不同，因而蛋白性質也不同，缺乏程度的量化標準。故今后中醫證候及中醫藥的蛋白質組學的研究，應逐步建立統一的程度量化標準，以消除不同結果間的差異。并應盡量保證研究的連續性，深入研究分析這些蛋白質，對差異結果進行再驗證和功能分析，尋找更好的干預靶點。

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