神經生長因子對哮喘大鼠氣道炎癥中TNF-α表達的調節作用

佘巍巍 陳 峰 羅 淼 (桂林醫學院附屬醫院呼吸內科，廣西 桂林 541001)

哮喘是多種炎性細胞、炎癥介質參與的慢性氣道炎癥性疾病，哮喘的發病機制非常復雜，至今尚未完全闡明。神經生長因子(NGF)不僅作用于神經系統，也影響機體免疫和造血系統，與變態反應性和炎癥性疾病的發病有關。近年來研究發現哮喘及其他許多致敏性疾病的發病可能與NGF直接相關〔1，2〕，目前已在支氣管哮喘的動物模型上證實NGF在哮喘炎癥的發生發展和維持中起著重要的作用〔3〕。本研究通過檢測各組大鼠肺組織內NGF、嗜酸性粒細胞及TNF-α的表達量的變化，判斷NGF是否通過調節TNF表達參與哮喘發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 清潔級雌性SD大鼠，非卵蛋白飼養，按隨機數字表法將小鼠隨機分為分為對照組(A組)、哮喘組(B組)和 NGF阻斷組(C組)，每組10只。雞卵清蛋白(OVA，V級，由美國Sigma公司提供)，抗-NGF抗體(由武漢博士德生物有限公司提供)。

1.2 動物制模 A組:致敏過程以PBS代替OVA注射，激發過程以鹽水霧化吸入，相關參數與B組相同;B組哮喘模型的構建方法于實驗第1、第14天致敏，即卵白蛋白20 μg由1 mg氫氧化鋁乳化，總體積200 μl，腹腔注射。第21～27天，將大鼠置于密閉容器內，以超聲霧化器霧化3%OVA鹽水氣溶膠吸入激發，每天1次，每次30 min。C組哮喘模型建立同哮喘組，但于每次激發前3 h，先經鼻滴入抗大鼠β-NGF抗體(稀釋1∶50)50 μl，每日 1 次，連續 7 d。

1.3 各組大鼠哮喘發作情況觀察與評分 最后一次激發后5 min，采用評分法比較各組動物在激發后的反應情況:無發作者計0分;僅出現輕度呼吸急促，無躁動不安和發紺者計1分;明顯呼吸急促、躁動不安和發紺者計2分;呼吸極度困難，并出現俯伏不動、反應遲鈍者計3分。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞計數 大鼠末次激發后24 h麻醉，結扎右肺，從氣管注入無菌磷酸鹽生理鹽水緩沖液4 ml灌洗左肺，反復6次，回收率50% ～90%，將收集到的全部支氣管肺泡灌洗液離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液置于－20℃低溫冰箱保存，高倍鏡下計數400個細胞行細胞分類計數。

1.5 支氣管肺組織病理檢測〔4〕灌洗后經氣管向右肺注4%多聚甲醛使胸膜展平后，置4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋，切片，厚度約5 μm，HE染色，顯微鏡下觀察支氣管肺組織病理特征。

1.6 免疫組織化學 石蠟切片經常規處理后，原位分子雜交，石蠟切片經常規處理后，按經典方法進行原位分子雜交。陰性對照用PBS代替上述抗體。原位雜交比較三組TNF-α水平，RT-PCR半定量法測定哮喘大鼠組及正常對照組肺組織NGF mRNA表達，Western印跡法檢測三組NGF蛋白水平變化;觀察NGF、TNF-α及其mRNA在肺組織的表達，并用顯微圖像分析系統測定8個視野的陽性系數和灰度值。NGF、TNF-α及其mRNA陽性細胞均以胞質著色為主，陽性顆粒呈棕褐色或棕黃色。

1.7 統計學處理 所有統計數據用SPSS 13.0統計軟件處理。數據以表示，多樣本均數比較采用F檢驗。相關性檢驗采用Pearson直線相關分析。

2 結果

2.1哮喘大鼠哮喘發作分析 哮喘組大鼠發作評分與正常對照組差異顯著(P＜0.05);NGF阻斷組大鼠發作評分低于哮喘組(P＜0.05);NGF阻斷組大鼠支氣管肺泡灌洗液中嗜酸粒細胞數明顯低于哮喘組(P＜0.05);哮喘組及NGF阻斷組大鼠支氣管肺泡灌洗液中嗜酸粒細胞數均明顯高于正常對照組(P＜0.05)。按哮喘大鼠的發作程度行等級相關研究，隨哮喘大鼠臨床發作越重，嗜酸粒細胞數越，兩者呈正相關。

2.2 NGF蛋白及NGF-mRNA的表達與TNF-α蛋白及TNF-α mRNA的表達 哮喘組大鼠肺組織NGF蛋白、NGF mRNA的平均灰度值分別為145±7、128±7;對照組分別為189±7、191±6;抗NGF干預組分別為156±6、139±8;三組比較差異顯著(t=19.50、15.90、14.89，均 P ＜0.05);而哮喘組大鼠TNF-α 蛋白及TNF-α mRNA 的灰度值分別為141±7、127±7，對照組分別為175±8、179±9，抗NGF干預組分別為164±8、155 ±6，三組差異顯著(t=28.40、21.75、22.22，均 P ＜0.01)。各組大鼠肺組織NGF蛋白平均陽性系數為:B組＞A組，C組 ＜B組(t=1.29、3.85、2.19，均 P ＜0.05);其陽性產物平均灰度值(待測物質灰度值越高，表明其在細胞中表達的量越低，反之，灰度值越低表明其在細胞中表達的量越高，下同)，其NGF mRNA平均陽性系數為:B組＜A組，C組＞B組(t=1.24、3.65、2.14，均 P ＜0.05)。各組大鼠肺組織中 TNF-α 蛋白平均陽性系數為:B組＞A組，C組＜B組(t=1.61、3.80、2.35，均P＜0.01);其 TNF-α mRNA平均灰度值為:B組 ＞A組，C組 ＜B 組(t=1.47、3.81、2.19，均 P ＜0.01)。NGF 阻斷組其肺組織TNF-α的水平低于哮喘組肺組織TNF-α的水平(P＜0.05)。NGF阻斷組其肺組織NGF的水平低于哮喘組NGF的水平(P＜0.05)。按哮喘大鼠的發作程度行等級相關研究，隨哮喘大鼠臨床發作越重，NGF水平越高，兩者正相關。

3 討論

近年的研究發現，NGF是神經源性炎癥反應的重要介質〔5〕，通過連接神經系統和免疫系統而發揮放大氣道炎癥的作用。除了免疫源性機制外，氣道炎癥的神經源性因素日益受到重視。在本研究中，哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的NGF含量與氣道炎性指標嗜酸性粒細胞密切相關，表現為BALF中NGF含量越多，嗜酸性粒細胞浸潤數越多。在用抗NGF抗體處理過的大鼠氣道內，嗜酸性粒細胞明顯減少。這說明NGF促進嗜酸粒細胞在氣道內的浸潤，說明NGF可以促進氣道炎癥發展。這與國外文獻相符〔6〕，在哮喘病人血清和BALF液中NGF的水平亦明顯升高。

本研究顯示在哮喘發病過程中，NGF參與了發病過程。與國外實驗證明哮喘狀態下NGF及其受體表達升高〔7，8〕相符，在本研究中行等級相關研究，我們進一步證實哮喘大鼠臨床發作越重，NGF水平越高，兩者呈正相關，表明檢測NGF有助于哮喘的臨床診斷和病情評估，并可能有助于判斷哮喘的發展與預后。本研究提示哮喘大鼠肺組織NGF水平高于NGF阻斷組，與國外報道一致。De-Vries等〔9〕報道給豚鼠靜脈注射NGF半小時后，便可誘發豚鼠氣道對組胺的高反應性，氣道阻力明顯增高，而NGF本身并不引起氣道阻力的改變。若用抗NGF抗體拮抗NGF，則能消除NGF引起的氣道功能改變，以上證據表明NGF可能是連接氣道炎癥和氣道高反應性的一架橋梁。

因國內外資料〔10，11〕均已證實TNF-α對氣道炎癥具有促進作用，哮喘組大鼠血清、BALF中的TNF-α濃度較正常對照組增高，通過趨化激活中性粒細胞等炎性細胞共同參與氣道炎癥的形成，在氣道炎癥的持續和放大中起到重要放大作用，說明其在氣道炎癥發病中具有重要意義。本實驗表明拮抗NGF生物活性則能夠有效抑制TNF-α的合成和分泌。我們判斷哮喘大鼠發作時可能系由肺組織TNF-α mRNA表達增加，TNF-α生成增多所致，阻斷內源性NGF可降低哮喘大鼠肺組織TNF-α mRNA的表達，NGF可通過調節TNF的表達而促進氣道神經源性炎癥過程，提示NGF可能通過調節TNF-α的表達參與哮喘發病，這從分子生物學的角度進一步說明了NGF及TNF與哮喘氣道炎癥的發生密切相關，NGF可能通過增進肺組織TNF-α mRNA的表達作為參與哮喘的發病機制之一。以上結果提示NGF是調控神經源性炎癥的關鍵性細胞因子，通過連接神經系統和免疫系統發揮放大氣道炎癥的作用，為進一步闡明哮喘氣道神經源性的機制奠定基礎，為哮喘的預防和治療提供新的可能途徑。

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11 劉曉湘，曹德壽，閆軍浩，等.NGF對哮喘豚鼠下呼吸道及內臟感覺傳入部位TNF-α mRNA表達的上調作用〔J〕.解剖學報，2004;35(3):225-9.