抗氧化應激轉錄因子－Nrf2的研究進展*

林曉萍， 李 雯， 沈華浩

(浙江大學醫學院附屬第二醫院呼吸科，浙江杭州310009)

細胞毒物、致癌物以及親電子試劑在外界環境中無處不在，這些物質及其代謝產物直接或間接干擾DNA、蛋白質和脂質等生物大分子的生理功能，參與各種疾病包括腫瘤、老化、哮喘、急性肺損傷、動脈粥樣硬化、神經退行性疾病和自身免疫病等疾病的病理生理過程，時刻威脅人類健康。為了對抗各種外來物質的攻擊，細胞在進化過程中逐漸獲得了對抗這些毒性物質的防御能力。其中一個對抗氧化應激最重要的細胞防御機制是由核因子E2相關因子2(nuclear factor－E2－related factor 2，Nrf2)所介導的，Nrf2通過與胞漿蛋白Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白－1(Kelch－like epichlorohydrin－associated protein 1，Keap1)以及抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，啟動下游編碼抗氧化蛋白和II相解毒酶的基因表達，發揮細胞保護作用。

1 Nrf2、Keap1基本結構

1.1 Nrf2的基本結構 Nrf2是CNC(cap'n'collar)轉錄因子家族成員中活力最強的轉錄調節因子，主要表達于如肝臟、腎臟等代謝和解毒組織中，以及其它持續暴露在環境中的組織如皮膚、肺、消化道等，普遍表達于各種細胞［1］。

人類Nrf2與雞、鼠Nrf2具有同源性，均含有6個高度保守的環氧氯丙烷(epichlorohydrin，ECH)相關蛋白同源結構域(Nrf2－ECH homology，Neh)［1－3］。分別如下:(1)Neh1 區:含 1 個 CNC 類型的堿性亮氨酸拉鏈結構(basic leucine zipper，bZ-ip)，必須與其它轉錄因子形成異二聚體后才能識別并結合ARE，啟動目標基因轉錄。此外，該區還含有功能性核定位信號(nuclear localization signal，NLS)和富含亮氨酸的核輸出信號(nuclear export signal，NES)，參與調控Nrf2的核轉位和降解;(2)Neh2區:與胞漿蛋白Keap1的Kelch區相結合;(3)Neh3:是活化轉錄所必需的，通過招募共激動劑－染色質解螺旋酶DNA結合蛋白6(chromodomain helicase DNA－binding protein 6，CHD6)活化轉錄，不過目前還不知道CHD6的特定功能;(4)Neh4和Neh5:富含酸性氨基酸殘基，是2個獨立的激活區，二者協同激活環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cyclic AMP response element－binding protein，CREB)結合蛋白(CREB－binding protein，CBP);(5)Neh6區:富含絲氨酸殘基，與Nrf2氧化－還原非依賴的負性調節有關，但目前尚不清楚其作用或重要性。

1.2 Keap1的基本結構 Keap1是Kelch家族多區域阻遏蛋白。正常情況下錨定于胞漿、栓在肌動蛋白細胞骨架上［2，3］。人類Keap1蛋白一級結構包含5個區，分別是:(1)N末端區域;(2)BTB(bric－abrac/tramtrack/broad complex):是在肌動蛋白結合蛋白和鋅指轉錄因子中發現的一個蛋白－蛋白相互作用的進化保守基序，通常和其它BTB區形成二聚體，是Keap1與Nrf2解離、阻止II相基因轉錄所必需的;(3)干預區(intervening region，IVR):該區域不僅富含半胱氨酸，而且含有Keap1活性最強的半胱氨酸殘基，是整個蛋白的功能調節區，不僅參與親電化合物及氧化劑的反應，同時還參與形成泛素化連接酶、穩定Nrf2;(4)雙甘氨酸或Kelch重復區(double glycine or Kelch repeat，DGR區):含有6個雙甘氨酸重復序列或6個Kelch模序，重復的Kelch模序形成6片經典的β螺旋，含有多個潛在的蛋白質結合位點，是Keap1與Neh2區結合的位點，也是Keap1與胞漿肌動蛋白結合的位點［2，3］;(5)C 末端。

2 Nrf2－Keap1系統活化的機制

目前認為，Nrf2的活性主要由Keap1負性調節。在基礎條件下，細胞氧化－還原內環境維持穩定，絕大部分 Nrf2以非活性狀態儲存于細胞質中，與Keap1相偶聯，后者與胞漿肌動蛋白結合而被錨定在胞漿，通過泛素介導的蛋白降解系統維持Nrf2的基礎水平;另一部分Nrf2以活性狀態存在于細胞核中介導基因的基本轉錄。當受到親電子物質或氧化劑作用時，通過細胞內信號通道途徑，如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)和(或)絲裂酶原激活蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)途徑，Keap1感受到氧化－還原狀態失衡，其半胱氨酸殘基被修飾，導致E3泛素連接酶構象改變、不利于Nrf2泛素化，從而導致Nrf2發生磷酸化，與Keap1解耦聯、轉移入核，與其專性伴侶－肌腱膜纖維肉瘤蛋白(musculoaponeurotic fibrosarcoma protein，Maf)結合成異二聚體，識別并結合ARE，啟動II相解毒酶及細胞內氧化－還原平衡蛋白基因等多種不同類型基因轉錄［2］。氧化－還原平衡一恢復，Nrf2與ARE序列解離，輸出到胞漿，通過Cullin3依賴的E3泛素連接酶機制進行泛素化后降解，關閉Nrf2通路，重新維持低水平的Nrf2。

2.1 Nrf2與Keap1相互作用的位點 Nrf2的Neh2區存在2個不同親和力的Kelch重復區域結合位點－ETGE模序和DLG模序。反向雙雜交篩選實驗顯示鼠Neh2區的ETGE模序能夠參與Keap1 Kelch重復區的高親和力反應［4］。Kelch重復區和含有ETGE的Neh2合作結晶學顯示Nrf2酸性肽77DEETGE82形成緊湊的β－轉角結構，參與多個堿性氨基酸(第380、415和483個精氨酸，第436個組氨酸)和位于鼠及人類Keap1 Kelch重復區底部的極性氨基酸(第334、525和572個酪氨酸，第363、508和555個絲氨酸，第382個天冬酰氨酸)之間的高親和力反應。

Neh2區與Keap1第二親和力的位點，稱為DLG模序［5］。Kelch重復區的晶體學發現其包圍環繞著DLG模序，揭露了Nrf2的27DIDLGV32與Keap1 Kelch重復區的反應方式和ETGE模序相似，第26個谷氨酰氨酸、第27和29個天氨酸被結合的方式與第79個谷氨酸、第80個蘇氨酸和第82個谷氨酸相似。然而，DLG肽與Kelch重復序列產生的相互靜電作用比ETGE肽產生的少。

2.2 Nrf2－Keap1系統活化的機制 Keap1蛋白富含活性半胱氨酸，由于位于堿性氨基酸旁邊，大約一半具有高度活性，其巰基pKa減小易于形成硫離子，與親電子劑形成復合物或者易于被氧化。在體外烷化反應和體內定點突變實驗均鑒定出只有保守的第151、273和 288個半胱氨酸(cysteine 151，273 and 288，C151、C273和C288)殘基是Keap1的功能亞基，缺乏這3個半胱氨酸殘基的Keap1突變體無法負性調節 Nrf2［6，7］。C151 點突變為絲氨酸的 Keap1 突變體抑制Nrf2的能力與野生型Keap1相當，但是前者不可逆地抑制了Nrf2的活化，使ARE下游基因表達減低、氧化－還原應激無法誘導，所以C151很可能是Nrf2誘導劑直接烷化的主要位點［6］。C273或C288點突變為絲氨酸的Keap1突變體可以結合Nrf2，但是無法抑制Nrf2［7］。這些數據表明C151是Nrf2通路活化所必須，而C273、C288是抑制Nrf2所必須的。我們推論這3個半胱氨酸殘基可能是keap1－Nrf2感受氧化－還原狀態的中心，但具體機制有待進一步研究。

2.3 Keap1抑制Nrf2的模型

①模型1:胞漿錨定模型 該模型認為在正常內環境穩態下，Nrf2與Keap1相互作用而停留在胞漿里。氧化應激時，二者解偶聯，Nrf2從胞漿轉移到核內。Keap1通過結合肌動蛋白而與細胞支架聯合在一起支持了這個模型［3］;另一種可能是Keap1通過結合磷酸變位酶家族成員5(PGAM5)與線粒體聯合［8］。因此，當親電子試劑或氧化劑攻擊時，Nrf2可能從細胞支架或者線粒體結合部位解離。

②模型2:核－漿穿梭模型 這個模型通過氧化－還原應激調節Nrf2。在正常內環境穩態下，Keap1將Nrf2保留在1個亞核隔離區，限制Nrf2的核含量，阻止與其下游基因啟動子ARE序列結合;應激狀態下，核蛋白前胸腺素結合Keap1的Kelch重復區域，從而釋放Nrf2，激活其下游基因［9］。Nrf2的核定位信號(NLS)和核輸出信號(NES)之間的平衡調節Nrf2在細胞中的穿梭運動以及Nrf2的降解。輸出蛋白Crm－1可與Nrf2的NES結合，調控Nrf2進行核輸出和降解。位于Neh5區內的NES有一個內源性半胱氨酸，由氧化劑或親電子試劑修飾后，可阻止識別輸出蛋白Crm－1的模序，導致Nrf2核堆積;bZIP區內的NES緊鄰第568個酪氨酸，在氧化應激期間，該酪氨酸發生磷酸化，可能阻止輸出蛋白Crm－1介導的Nrf2核輸出［2］。也有研究認為糖原合成酶激酶－3(glycogen synthase kinase 3，GSK －3)參與Nrf2的穿梭運動。GSK－3屬于保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，包括GSK－3α(51 kD)和 GSK －3β(47 kD)2種亞型，目前研究主要集中在GSK－3β。GSK－3β具有廣泛的細胞功能，參與細胞凋亡、新陳代謝、蛋白質翻譯及基因表達;還介導Nrf2磷酸化、抑制其核轉位［10］。

③模型3:泛素化降解模型 這個模型說明在正常內環境穩態下，在Keap1依賴的形式下，Nrf2不斷被26S蛋白酶體降解。2004年，已證明Keap1是負責Nrf2降解的Keap1－Cullin3－Rbx1 E3泛素連接酶復合體的底物銜接蛋白［11］。在基礎條件下，Keap1通過其 BTB區結合 Cullin3、Kelch區結合 Nrf2，將Nrf2連接到E3復合體，使泛素從E3轉移到Nrf2的賴氨酸殘基;同時，Cullin3結合ring－box1(Rbx1，也稱為Roc1)，形成一個核心E3泛素連接酶復合體。從而，泛素化的Nrf2很快由26S蛋白酶體降解而保持Nrf2通路關閉。

④模型4:Nrf2基因誘導模型 Nrf2基因啟動子包含ARE序列和異源物質反應元件(xenobiotic responsive element，XREs)。ARE序列對一些具有抗氧化能力的外來物反應，XRE則由轉錄因子芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)激活，主要調節 I相代謝酶表達。3H－1，2－二硫雜環戊二烯－3－硫酮和萊菔硫烷處理后，鼠角質化細胞的Nrf2 mRNA水平增高［12］，表明Nrf2基因啟動子中含有ARE序列;2，3，7，8－四氯二苯二氧芑處理后，肝癌1c1c7細胞的Nrf2蛋白和mRNA含量均增加，這與Nrf2基因啟動子存在 XREs相一致［2］。

由于這些機制可能在不同的生理狀態下執行，所以這4個模型不相互排斥，可以獨立存在，亦可相互補充。

3 Nrf2的功能

Nrf2介導的抗氧化反應是一種主要的細胞防御機制。Nrf2缺失或激活障礙，可加重氧化應激源的細胞毒性，導致細胞功能障礙、凋亡甚至死亡。在過去20年里，有關Nrf2、氧化應激與人類不同疾病發病機理關系的研究增多，這些疾病包括:腫瘤、哮喘等呼吸系統疾病、動脈粥樣硬化、神經退行性疾病和老化過程。

3.1 Nrf2活化預防和促進腫瘤

①Nrf2活化預防腫瘤作用 50多年的研究鑒定出許多來源于植物的化合物－植物化學物質，具有化學預防功能;同時也已鑒定出許多化學預防化合物是Nrf2的誘導劑。植物來源的強Nrf2誘導劑包括:萊菔硫烷(十字花科蔬菜)、姜黃素(香料)、表兒茶素酸酯(綠茶)、白藜蘆醇(葡萄)、咖啡酸苯乙酯(松樹)、咖啡醇和咖啡白(咖啡)、番茄紅素(番茄)。除了植物化學物質外，有些合成的化學藥品如奧替普拉也是強Nrf2誘導劑。這些化學預防復合物通過誘導Nrf2依賴的適應性反應，包括II相解毒酶、抗氧化劑和防止細胞隨后發展成腫瘤的運載體，發揮其化學預防功能。因此，認為Nrf是一個“好”蛋白，保護人類免受致癌物質所致的遺傳損傷。

許多使用Nrf2敲除小鼠的體內研究進一步證明了Nrf2在腫瘤預防中的關鍵作用。Nrf2敲除小鼠的II相基因如谷胱甘肽S轉移酶(glutathione S－transferase，GST)、還原型輔酶Ⅰ醌類氧化還原酶［NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1］和谷氨酰半胱氨酸連接酶(glutamate－cysteine ligase，GCL)的基礎和誘導水平均減少。Nrf2敲除小鼠對化學毒物和致癌物質的敏感性增高，對腫瘤預防復合物的保護作用產生抵抗。

②Nrf2促進腫瘤 令大家驚奇的是，新的研究揭示出Nrf2也有“陰暗面”，它不僅能阻止正常細胞轉化成腫瘤細胞，但在有害環境中也能促進腫瘤細胞的生長。腫瘤細胞系或者腫瘤組織通過Keap1突變或基因雜合性丟失，上調Nrf2蛋白水平及其下游基因的轉錄，從而促進腫瘤的生長。人體研究也表明，肺腺癌患者有高Keap1體細胞突變發生率;在乳腺癌患者中發現Keap1第23個半胱氨酸點突變損害了Keap1抑制Nrf2轉錄的功能，雖然其仍能與Nrf2和Cullin3相互作用，但無法有效地促進 Nrf2泛素化［13］。綜上所見，Keap1功能喪失可能會導致Nrf2長期活化，上調Nrf2下游基因從而給癌細胞提供生長幫助。

另外，Nrf2誘導化學耐藥也可能是促進腫瘤生長的機制。Nrf2穩定過表達能增強腫瘤細胞對順鉑、阿霉素和足葉乙甙等化療藥的耐藥性，相反，使用小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾Nrf2后，能增加腫瘤細胞對這些化療藥物的敏感性。同樣，應用小分子化學藥物－特丁基對苯二酚(tertiary butylhydroquinone，tBHQ)激活Nrf2也能增強腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性［14］。

3.2 Nrf2在氣道疾病中的保護作用 整個支氣管氣道上皮細胞襯液和組織中含有豐富的胞內、胞外抗氧化劑。由于氣道首先與吸入性氧化劑接觸，其氧化－還原平衡可被增強的氧化負擔反復打亂。已知許多急、慢性呼吸系統疾病的發病機理與氧化應激有關，包括肺氣腫/慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、哮喘、急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、肺惡性腫瘤、特發性肺纖維化和囊性纖維化。

①肺氣腫/慢性阻塞性肺疾病(COPD) 多個人類研究表明，老年吸煙者和COPD患者中肺組織和肺泡巨噬細胞中Nrf2－Keap1－Bach1平衡低下，Bach1和Keap1水平增高。相比Nrf2+/+小鼠，長期暴露于香煙煙霧(4或6個月)的Nrf2－/－小鼠，將導致更嚴重的肺氣腫癥狀、氧化DNA加合物形成增多、細胞凋亡并抑制肺抗氧化酶［15］。

②哮喘和過敏性氣道疾病 動物實驗研究表明，Nrf2缺陷使卵白蛋白誘發的氣道炎癥和高反應性增強;Nrf2－/－小鼠還同時伴隨顯著的肺黏液細胞過度增生、嗜酸性細胞浸潤、Th2細胞因子IL－4和IL－13增多以及體內多種抗氧化劑功能受抑制。暴露于環境中各種氧化劑，例如臭氧或汽車尾氣顆粒(diesel exhaust particle，DEP)等顆粒物質，能引起哮喘樣癥狀或者加重原有氣道變應性疾病。DEP包含許多前氧化劑和醌、多環芳烴等致癌物質，能夠誘導肺泡巨噬細胞和支氣管上皮細胞1型血紅素氧化酶(heme oxygenase 1，HO－1)、GST和其它 II相酶表達。研究已經闡述了Nrf2－ARE信號通路在DEP誘導的肺氧化應激和損傷中的重要性。他們發現暴露于大劑量 DEP(3 mg/m3)后，Nrf2－/－小鼠形成的DNA加合物比Nrf2+/+小鼠明顯增多;暴露于低劑量DEP(100 μg/m3)后，Nrf2－/－小鼠氣道高反應性以及淋巴細胞和嗜酸性細胞的炎癥顯著增強［16］。總的來說，Nrf2介導的抗氧化通路可決定對不同過敏原引起肺部疾病的敏感性。

③ ALI/ARDS Cho 等［17］通過對比 Nrf2+/+和Nrf2－/－小鼠對組織高氧的不同反應來證明Nrf2是ALI模型中一個候選易感基因。相比野生型小鼠，Nrf2－/－小鼠肺高通透性、炎癥浸潤和上皮損傷增強;與Nrf2－ARE通路在高氧引起的肺毒性中的保護作用一致，Nrf2－DNA結合活性和多種抗氧化酶(如GST、NQO1、GCL、HO － 1)的表達在 Nrf2－/－小鼠中明顯減弱。在高潮氣量機械通氣引起的呼吸機相關性肺損傷(ventilator－induced lung injury，VILI)小鼠模型中發現，與Nrf2+/+小鼠相比，Nrf2－/－小鼠肺泡和血管通透性以及VILI相關的前炎癥因子水平升高，ARE反應性谷胱甘肽合成酶水平減少，氧化－還原平衡破壞［18］。調查人員還發現小鼠Nrf2在實驗性顱腦損傷所致的ALI中發揮調節作用。通過中度體重下降誘發小鼠腦損傷，與 Nrf2+/+小鼠相比，Nrf2－/－小鼠肺毛細血管通透性、濕/干重比和肺泡細胞凋亡加劇;肺損傷加重與炎癥因子(TNF－α、IL－1β、IL－6)表達增多和肺抗氧化和解毒酶(NQO1、GST)減少有關［19］。

④彌漫間質性肺纖維化 Nrf2介導的抗氧化通路是限制博來霉素誘導的肺纖維化所必須的。已經闡明了ARE下游的抗氧化酶在實驗性纖維化中的保護作用。通過給予多酚表兒茶素酸酯活化Nrf2－ARE反應可以減輕博來霉素誘導的大鼠肺損傷和炎癥［20］。盡管沒有明確的證據證明Nrf2在人纖維化患者中的作用，但是觀察到IPF患者肺中Nrf2表達伴隨著氧化劑標記增多，這說明二者是有關聯的。

3.3 Nrf2參與動脈粥樣硬化 氧化應激和炎癥是促進動脈粥樣硬化斑塊形成的2個關鍵因素。Dai等［21］使用siRNA技術抑制血管內皮細胞Nrf2表達，同時聯合全基因組轉錄譜，確定Nrf2是改變血管內皮細胞氧化－還原平衡的一個關鍵性決定因素。在2種標準動脈切應力下培養人血管內皮細胞，并從經典的動脈粥樣硬化模型2個不同血管區域－“易感”區和“耐受”區中分離出動脈粥樣硬化保護劑－氯貝丁酯，從而證明“動脈粥樣硬化保護”流通過磷酸酰肌醇激酶(PI3K)/Akt通路差異激活小鼠主動脈粥樣硬化“耐受”區和“易感”區的Nrf2及其下游轉錄因子，來維持血管內皮細胞內氧化－還原平衡、減輕氧化應激所致的損傷。

但是，Sussan 等［22］將 Nrf2－/－小鼠與載脂蛋白 E缺陷 (ApoE－/－)小鼠雜交，同時予 ApoE－/－和ApoE－/－Nrf2－/－小鼠致動脈粥樣硬化的飲食 20周，最終在主動脈形成粥樣硬化斑塊。與ApoE－/－小鼠相比，ApoE－/－Nrf2－/－小鼠形成的斑塊面積明顯減小(29.5% 比 11.5%)，而且，斑塊面積減少與ApoE－/－Nrf2－/－小鼠巨噬細胞攝取修飾后低密度脂蛋白的量顯著減少有關;后來，從 ApoE－/－Nrf2－/－小鼠分離的巨噬細胞和動脈粥樣硬化斑塊中發現清道夫受體－分化抗原簇36(cluster of differentiation 36，CD36)表達減少。以上表明，盡管Nrf2有抗氧化功能，但其在小鼠體內是一個促動脈粥樣硬化劑，這個促進作用可能通過陽性調節CD36分子介導。總之，Nrf2在動脈粥樣硬化中的作用仍需進一步研究，以幫助制定有利于預防動脈粥樣硬化斑塊形成的治療策略。

再者，活化的Nrf2也可抑制血管平滑肌細胞增殖;保護缺血－再灌注損傷對心肌細胞的損害。

3.4 Nrf2對急性神經損傷、神經退行性變、大腦缺血等有保護作用 體內外模型均顯示Nrf2－ARE通路能有效阻斷由于谷胱甘肽消耗、脂質過氧化、胞內鈣超載、神經興奮性毒素和線粒體電子傳遞鏈斷裂而致的神經毒性，而且還能增加神經元能量和氧化－還原電位、抑制性神經遞質信號和代謝過程。星形膠質細胞－運動神經元共培養實驗數據表明星形膠質細胞分泌的谷胱甘肽是Nrf2活化后產生神經保護作用的一個主要組成部分，它由谷氨酸－半胱氨酸連接酶(GCL)和谷胱甘肽合成酶(GSH)連續作用合成，GCL催化亞基(glutamate cysteine ligase catalytic subunits，GCLC)和修飾亞基(glutamate cysteine ligase modulatory subunits，GCLM)組成了 GSH合成的限速酶復合物，Nrf2活化后GCLC和GCLM的表達均增多。與神經元相比，星形膠質細胞中優先活化的Nrf2使GSH合成更有效、含量更高，其分泌的GSH通過作為細胞外抗氧化劑和/或通過增加GSH合成前體利用率提高神經元GSH水平來保護神經元［23］。

此外，轉錄因子Nrf2還與炎癥、自身免疫性疾病、糖尿病、慢性腎功能衰竭等其它人類疾病的發病、預防有關。

總之，普遍表達于各種細胞的轉錄因子Nrf2介導的細胞防御機制在對抗各種環境應激和內源性應激的反應中發揮重要作用，是參與腫瘤預防、腫瘤耐藥、哮喘、COPD、神經和血管保護的重要效應分子。因此，我們應深入研究 Nrf2，闡明 Nrf2－Keap1－ARE通路對不同氧化應激反應的確切調控機制，闡明功能受損的Nrf2－Keap1系統與人類不同疾病之間的相關性，利用該通路作為疾病預防控制以及治療策略的靶點，為人類健康造福。

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