調節性容積減小過程中Ca2 + 和pH 對鉀通道的調控*

楊林杰， 王立偉， 陳麗新△

( 暨南大學醫學院1 藥理學教研室，2 生理學教研室，廣東 廣州510632)

動物細胞在低滲環境中容積脹大時可以發生保護性的調節性容積減小( regulatory volume decrease，RVD) ，K+通道的開放所介導的K+外流是這一過程的重要機制［1］。然而，由于研究技術和方法的限制，對于離子通道活動的研究往往會破壞細胞的完整性和調節能力，因此RVD 過程中整體細胞水平的K+通道活動調節仍需進一步探討。而在已經充分掌握單個K+通道特性的基礎上，可以將不同的調節因素加以整合，構建RVD 過程中整體細胞水平K+通道活動的調節網絡。許多動物細胞的RVD 過程中存在胞漿Ca2+濃度和pH 值的改變，本文就這一變化的發生機制及其對RVD 過程中K+通道活動的調節作用作一綜述。

1 參與RVD 過程的K+通道類型

參與RVD 過程的K+通道類型與細胞類型有關。早期，在對腹水瘤Ehrlich 細胞的一系列研究表明，RVD 過程中介導容積敏感性K+電流( volume－activated K+current，IK，vol) 的是一種雙孔酸敏感性K+通 道( tandem－poredomain acid－sensitive K+channels，TASK) ，該通道的活動對pH 敏感，而不受胞漿的Ca2+濃度影響［2］。隨后，大量研究表明Ca2+依賴性K+通道參與多種細胞的RVD 過程，這些通道的活動受胞漿Ca2+濃度調節。在表皮樣癌KB－3－1 細胞中，低滲刺激可以激活中度電導Ca2+依賴性K+通道( intermediate－conductance Ca2+－activated K+channel，IK1) ，后者在RVD 過程中起關鍵作用［3］。在人眼篩板細胞中，低滲刺激可以導致大電導Ca2+依賴性K+通道( large－conductance Ca2+－activated K+channel，BK) 激活［4］。最近，部分研究表明同一種細胞的RVD 過程可以同時有Ca2+依賴性和電壓依賴性K+通道發揮作用。電壓依賴性K+通道( voltage activated K+channel，Kv) 亞型Kv1.3是參與T 淋巴細胞RVD 過程的主要K+通道類型，同時，IK1 也參與這一過程［5］。Harron 等［6］證實，電壓依賴性K+通道Kv4.1、Kv4.3 和Ca2+依賴性K+通道BK、IK1 在人類呼吸道上皮Calu－3 細胞RVD過程中均發揮作用。本課題組最近的研究提示Ca2+依賴性和電壓依賴性K+通道在人低分化鼻咽癌CNE－2Z 細胞RVD 過程中均發揮作用，其中IK1 的作用更為重要［7］。

因此，在不同類型甚至同一類型細胞中可以有不同類型的K+通道參與RVD 過程，其中Ca2+依賴性K+通道的活動受胞漿Ca2+濃度調節，而另一部分類型K+通道則對pH 值、電壓等因素敏感。RVD 過程中Cl－大量外流可以引起細胞膜去極化，為電壓依賴性K+通道的激活提供條件。下面，我們主要針對RVD 過程中胞漿Ca2+濃度和pH 值的變化、機制及其對K+通道活動的調節作用展開論述。

2 RVD 過程中的胞漿Ca2+濃度改變及影響

2.1 RVD 過程中胞漿Ca2+濃度改變 在腎小管上皮細胞、腦膠質細胞、關節軟骨細胞等多種哺乳動物中，低滲刺激引起的細胞容積脹大和RVD 過程中均伴隨有胞漿Ca2+濃度的升高，并且這一特征性改變在RVD 過程中發揮重要作用［8－11］。盡管在急性分離的小鼠膽管細胞中觀察到該細胞RVD 過程不完全依賴于細胞內、外Ca2+，但Ca2+在其RVD 過程中同樣發揮作用［12］。

2.2 TRP 通道家族在胞漿Ca2+濃度升高中的作用

瞬時受體電位( transient receptor potential，TRP) 通道家族廣泛表達于多種動物細胞，是一類機械敏感的非選擇性陽離子通道，在RVD 過程中胞漿Ca2+濃度升高中發揮一定作用。目前，對于TRP 通道家族香草素受體類亞型4( transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4) 在RVD 過程中的作用研究較多，普遍認為該通道起到滲透壓感受器的作用，低滲刺激及隨后的RVD 過程中TRPV4 通道可介導胞外Ca2+內流，從而使胞漿Ca2+濃度升高［13－15］。Pan 等［13］在人角質形成細胞系HaCaT 細胞中發現，TRPV4 通道激動劑和低滲刺激均可迅速導致胞漿Ca2+濃度升高3 倍，而利用TRPV4 通道阻斷劑、去除細胞外液中的Ca2+以及RNA 干擾( RNA interference，RNAi) 技術抑制TRPV4 基因表達均可以抑制低滲刺激引起的胞漿Ca2+濃度升高及RVD。最近的研究證實，TRPV4 通道蛋白N－末端的酪氨酸殘基在低滲刺激引起該通道激活的過程中起關鍵作用，Src 家族酪氨酸激酶( Src family tyrosine kinases，SFKs) 介導的N－末端酪氨酸磷酸化使通道對滲透壓敏感性增加［16］。此外，TRP 通道家族的其它通道類型也參與這一過程。在脊椎動物細胞中，對牽張刺激敏感的TRPV1、TRPV2 以及TRP 通道家族經典類亞型7( transient receptor potential channel 7，TRPC7) 均可以被低滲刺激引起的細胞容積脹大所激活［17］。Numata 等［18］在人上皮HeLa 細胞中證實，TRP 通道家族黑色素抑素類亞 型 7 ( transient receptor potential melastatin 7，TRPM7) 的激活和介導的Ca2+內流也參與調節細胞的RVD 過程。

TRP 通道家族活動的調節因素較多。胞漿Ca2+濃度過度升高可抑制TRPV4 的活動，表明該通道的活動調控過程中可能存在負反饋調節［19］。Kerrigan等［10］對牛關節軟骨細胞研究中發現，低滲剌激在急性分離和貼壁培養的細胞中導致的胞漿Ca2+濃度升高程度和RVD 比例均相同，然而，介導胞漿Ca2+濃度升高的主要離子通道對通道阻斷劑Gd3+的敏感性不同，提示細胞形態或狀態不同時，介導Ca2+內流的通道類型可能不同。因此，介導RVD 過程中胞漿Ca2+濃度升高的通道類型除與細胞類型有關，可能還受細胞狀態影響。總之，TRP 通道是一類重要的Ca2+內流途徑，在低滲刺激下TRP 通道開放介導細胞外Ca2+內流，引起胞漿Ca2+濃度升高，從而可以調節RVD 過程中其它Ca2+依賴性通道的活動。

2.3 胞漿Ca2+濃度升高對K+通道和RVD 的影響

低滲刺激引起的胞漿Ca2+濃度升高對RVD 的調節是一個復雜的過程，可能涉及到對多種酶活性、信號分子的生成以及對直接離子轉運系統活動的調節。由于Ca2+依賴性K+通道的活動直接受到胞漿Ca2+濃度所調節，低滲刺激導致的胞漿Ca2+濃度升高可以導致通道的激活。然而，Ca2+濃度升高對整體細胞水平RVD 過程的影響往往要復雜得多。例如在心肌細胞中，Ca2+濃度改變對RVD 起到雙向調節作用，低滲剌激導致的胞漿Ca2+濃度升高促進RVD，而Ca2+濃度的升高也使活性氧簇( reactive oxygen species，ROS) 生成增多，對RVD 過程產生抑制［20］。

3 RVD 過程中胞漿pH 值的變化及影響

3.1 RVD 過程中胞漿pH 值的變化 幾乎所有的細胞都具有比較完善的pH 值調節機制，在外界刺激以及多種生命活動過程中維持細胞內pH 值( intracellular pH，pHi) 的穩定。然而，多種細胞在低滲刺激后的RVD 過程中存在pHi降低。Lo 等［21］在骨肉瘤ROS17/2.8 細胞中發現，低滲刺激可以使細胞pHi降低約0.7，并且當細胞處于低滲環境中時pHi持續處于低水平。在腎上皮A6 細胞中，低滲刺激同樣可以使細胞pHi降低，并且細胞內的酸化可以抑制RVD［22］。

3.2 Ca2+在pH 降低中的作用 RVD 過程中出現的pHi降低與胞漿Ca2+濃度升高之間存在一定因果關系。Souza 等［23］對雞胚心肌細胞的研究表明，低滲刺激引起的pHi降低可能與胞漿Ca2+濃度升高使線粒體膜上的K+/H+和Ca2+/H+交換體活動增加，將線粒體中的H+轉運到胞漿有關。Kuo 等［24］在大鼠肺泡巨噬細胞的研究中發現，細胞內Ca2+濃度的升高可以導致pHi降低，同時可以激活一種pHi敏感的Ca2+依賴性質子通道，將細胞內的H+釋放到細胞外。

3.3 pH 值對TRP 通道的影響 pHi降低可以使細胞H+向胞外轉運增加，有助于pHi恢復，同時也使細胞外pH 值( extracellular pH，pHe) 降低，對一些通道的活動進行調控。Semtner 等［25］在人胚腎HEK－293 細胞中發現，pHe降低一方面可以使TRPC4 和TRPC5 通道的活動增加，另一方面也抑制TRPC6 通道活動。Cha 等［26］對倉鼠卵巢細胞的研究表明，pHi降低可以直接導致TRPV5 通道構像發生改變，使通道開放機率和單通道電導降低。因此，細胞外Ca2+內流和細胞內Ca2+濃度的升高在一定程度上也受到pH 值調節。總之，多種類型動物細胞的RVD 過程中都存在pHi降低，這一特征性改變與胞漿Ca2+濃度升高之間可以互相進行調節，從而對RVD 過程產生影響。

3.4 pH 改變對K+通道的影響 參與RVD 過程的多種 K+通道活動受到 pHi和/或 pHo調節。Hougaard 等［27］對腹水瘤Ehrlich 細胞的研究表明，參與RVD 過程的TASK 通道活動受細胞內、外pH 值改變調節。pH 值升高和降低可以分別激活和抑制IK，vol，pH 值升高時通道開放數量增多，低滲激活IK，vol的潛伏期縮短，甚至在等滲條件下自發激活。另外，部分研究提示Ca2+依賴性的K+通道也具有pH 敏感性。Pedersen 等［28］在HEK－293 細胞中觀察到IK1 通道活動具有pHi敏感性，而pHi降低使通道活動減弱，低pHi時提高胞漿Ca2+濃度也未能恢復通道活動。Church 等［29］對大鼠胚胎海馬神經元細胞BK 通道的研究中發現，在細胞內Ca2+濃度相同的條件下，pHi升高可以增加通道開放頻率，反之則導致通道開放頻率降低。

3.5 整體細胞水平研究K+通道調節的困難和可能性 參與RVD 過程的多種K+通道具有pH 敏感性，因此，細胞pHi調節能力正常的情況下在RVD 過程中細胞整體IK，vol水平可能會發生衰減。目前，對IK，vol特性的研究主要是基于膜片鉗技術，由于對RVD 和pH 調節能力影響較大，尚未觀察到RVD 過程中IK，vol的衰減過程。然而，在完整植物細胞的研究中直接觀察到質子泵活動對K+通道活動的調節。Shabala 等［30］采用自參比離子選擇性微電極技術在無損傷的情況下對植物跨膜離子流的研究中發現，質子泵活動產生的H+離子流和K+通道開放形成K+離子流的時相恰好相反，H+離子流為最小值時正好對應K+離子流的峰值，反之亦然。由于質子泵和K+通道活動均可能受pHi影響，H+和K+離子流的交替增減現象可能是pHi波動對質子泵和K+通道活動調控的結果，這為我們進行整體細胞水平離子通道活動調節提供了新的思路。

4 小結與展望

低滲刺激下，細胞容積脹大使TRP 通道激活，胞外Ca2+內流導致胞漿Ca2+濃度升高，使Ca2+依賴性K+通道激活促進RVD 的發生，同時也引起pHi的降低，后者又對參與RVD 過程的各種K+通道產生抑制作用。細胞膜上TRP 通道的活動又受到胞漿Ca2+濃度和pH 的調節。可見，RVD 過程中胞漿Ca2+濃度和pHi的改變構成一個反饋系統，從而形成K+通道活動的調節網絡。對整體細胞水平的離子轉運調控系統的研究有助于我們在科研和臨床工作過程中采用聯系、系統的方法進行分析，尋找調控系統中的關鍵環節，從而更有針對性地施加干預措施。

［1］ Okada Y. Ion channels and transporters involved in cell volume regulation and sensor mechanisms［J］. Cell Biochem Biophys，2004，41(2) : 233－258.

［2］ Niemeyer MI，Stutzin A，Sepulveda FV. A voltage－independent K+conductance activated by cell swelling in Ehrlich cells is modulated by a G－protein－mediated process［J］. Biochim Biophys Acta，2002，1562(1－2) : 1－5.

［3］ Lee EL，Hasegawa Y，Shimizu T，et al. IK1 channel activity contributes to cisplatin sensitivity of human epidermoid cancer cells［J］. Am J Physiol Cell Physiol，2008，294(6) : C1398－C1406.

［4］ Irnaten M，Barry RC，Quill B，et al. Activation of stretch－activated channels and maxi－K+channels by membrane stress of human lamina cribrosa cells［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50(1) : 194－202.

［5］ Cahalan MD，Chandy KG. The functional network of ion channels in T lymphocytes［J］. Immunol Rev，2009，231(1) : 59－87.

［6］ Harron SA，Clarke CM，Jones CL，et al. Volume regulation in the human airway epithelial cell line Calu－3［J］.Can J Physiol Pharmacol，2009，87(5) : 337－346.

［7］ 和樹同，朱林燕，楊林杰，等. 鈣依賴性鉀通道在鼻咽癌細胞調節性容積回縮中起重要作用［J］. 生理學報，2009，61(5) :485－492.

［8］ Xu C，Shmukler BE，Nishimura K，et al. Attenuated，flow－induced ATP release contributes to absence of flow－sensitive，purinergic Ca2+i signaling in human ADPKD cyst epithelial cells［J］. Am J Physiol Renal Physiol，2009，296(6) : F1464－F1476.

［9］ Rojas H，Ramos M，Benaim G，et al. The activity of the Na+/Ca2+exchanger largely modulates the Ca2+i signal induced by hypo－osmotic stress in rat cerebellar astrocytes.The effect of osmolarity on exchange activity［J］. J Physiol Sci，2008，58(4) : 277－279.

［10］ Kerrigan MJ，Hall AC. Control of chondrocyte regulatory volume decrease( RVD) by［Ca2+］iand cell shape［J］.Osteoarthritis Cartilage，2008，16(3) : 312－322.

［11］ Haeberle H，Bryan LA，Vadakkan TJ，et al. Swelling－activated Ca2+channels trigger Ca2+signals in Merkel cells［J］. PLoS One，2008，3(3) : e1750.

［12］ Park JS，Choi YJ，Siegrist VJ，et al. Permissive role of calcium on regulatory volume decrease in freshly isolated mouse cholangiocytes［J］. Pflugers Arch，2007，455(2): 261－271.

［13］ Pan Z，Yang H，Mergler S，et al. Dependence of regulatory volume decrease on transient receptor potential vanilloid 4( TRPV4) expression in human corneal epithelial cells［J］. Cell Calcium，2008，44(4) : 374－385.

［14］ Fernandes J，Lorenzo IM，Andrade YN，et al. IP3sensitizes TRPV4 channel to the mechano－ and osmotransducing messenger 5＇－6＇－epoxyeicosatrienoic acid［J］. J Gen Physiol，2008，131(5) : i2.

［15］ Yamada T，Ugawa S，Ueda T，et al. Differential localizations of the transient receptor potential channels TRPV4 and TRPV1 in the mouse urinary bladder［J］. J Histochem Cytochem，2009，57(3) : 277－287.

［16］ Wegierski T，Lewandrowski U，Muller B，et al. Tyrosine phosphorylation modulates the activity of TRPV4 in response to defined stimuli［J］. J Biol Chem，2009，284(5) : 2923－2933.

［17］ Yin J，Kuebler WM. Mechanotransduction by TRP channels: general concepts and specific role in the vasculature［J］. Cell Biochem Biophys，2010，56(1) : 1－18.

［18］ Numata T，Shimizu T，Okada Y. TRPM7 is a stretch－and swelling－activated cation channel involved in volume regulation in human epithelial cells［J］. Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(1) : C460－C467.

［19］ Plant TD，Strotmann R. Trpv4［J］. Handb Exp Pharmacol，2007，179: 189－205.

［20］ Rojas－Rivera D，Diaz－Elizondo J，Parra V，et al.Regulatory volume decrease in cardiomyocytes is modulated by calcium influx and reactive oxygen species［J］.FEBS Lett，2009，583(21) : 3485－3492.

［21］ Lo C，Ferrier J，Tenenbaum HC，et al. Regulation of cell volume and intracellular pH in hyposmotically swollen rat osteosarcoma cells［J］. Biochem Cell Biol，1995，73(7－8) : 535－C544.

［22］ Smets I，Ameloot M，Steels P，et al. Loss of cell volume regulation during metabolic inhibition in renal epithelial cells( A6) : role of intracellular pH［J］. Am J Physiol Cell Physiol，2002，283(2) : C535－C544.

［23］ Souza MM，Gross S，Boyle RT，et al. Na+/K+－ATPase inhibition during cardiac myocyte swelling: involvement of intracellular pH and Ca2+［J］. Mol Cell Biochem，2000，210(1－2) : 173－183.

［24］ Kuo TC. Regulation of intracellular pH by Ca2+－activated proton channel［J］. Immunopharmacol Immunotoxicol，2010，32(2) :313－320.

［25］ Semtner M，Schaefer M，Pinkenburg O，et al. Potentiation of TRPC5 by protons［J］. J Biol Chem，2007，282(46) : 33868－33878.

［26］ Cha SK，Jabbar W，Xie J，et al. Regulation of TRPV5 single－channel activity by intracellular pH［J］. J Membr Biol，2007，220(1－3) : 79－85.

［27］ Hougaard C，Jorgensen F，Hoffmann EK. Modulation of the volume－sensitive K+current in Ehrlich ascites tumour cells by pH［J］. Pflugers Arch，2001，442( 4) :622－633.

［28］ Pedersen KA，Jorgensen NK，Jensen BS，et al. Inhibition of the human intermediate－conductance，Ca2+－activated K+channel by intracellular acidification［J］. Pflugers Arch，2000，440(1) : 153－156.

［29］ Church J，Baxter KA，McLarnon JG. pH modulation of Ca2+responses and a Ca2+－dependent K+channel in cultured rat hippocampal neurones［J］. J Physiol，1998，511( Pt 1) : 119－132.

［30］ Shabala S，Shabala L，Gradmann D，et al. Oscillations in plant membrane transport: model predictions，experimental validation，and physiological implications［J］. J Exp Bot，2006，57(1) : 171－184.