蛋白質巰基亞硝基化對細胞功能的調控作用

張曉靜，叢 斌

(河北醫科大學基礎醫學院，河北 石家莊 050017)

近年來，人們發現一氧化氮(nitric oxide，NO)可對半胱氨酸巰基(－SH)進行氧化修飾，生成低分子量的亞硝基硫醇(RSNO)和高分子量的亞硝基化蛋白質(S－nitrosylated protein，PSNO)，前者包括亞硝基半胱氨酸(S－nitrosocysteine，CyS－SNO)和亞硝基谷胱甘肽(S－nitrosoglutathione，GSNO)，后者又稱蛋白質巰基亞硝基化(protein S－nitrosylation)。蛋白質巰基亞硝基化可改變蛋白質的構象，調節蛋白質的功能，被認為是一種與磷酸化相似的新的信號轉導調控方式，在許多生理和病理過程中發揮重要的調控作用。本文就蛋白質巰基亞硝基化(簡稱亞硝基化)對細胞功能的調控作用作一綜述。

1 亞硝基化作用的概述

亞硝基化作用是一種可逆性的蛋白質巰基氧化修飾方式，其修飾產物PSNO較穩定，比NO的半衰期長，但在強光、金屬離子和還原性物質如還原型谷胱甘肽、抗壞血酸鹽等的作用下易分解。PSNO可根據生命活動的需要及時釋放NO，當NO過量產生時又可迅速貯存NO，因此亞硝基化修飾被認為是機體儲存、釋放和運輸NO的主要方式。NO對蛋白質的亞硝基化不是NO與蛋白質分子之間的簡單結合，而是由一系列復雜的化學反應組成。首先，NO與氧反應產生一系列氮氧化物如三氧化二氮(N2O3)或四氧化二氮(N2O4)，這些氮氧化物可直接對含自由巰基蛋白質(用RSH表示)進行亞硝基化。化學反應式為:N2O3+RSH→RSNO+NO2－+H+［1］。第二，NO基團可在亞硝基化蛋白質與自由巰基之間快速交換，即轉亞硝基作用。化學反應式為:R1SH+R2SNO→R1SNO+R2SH［2］。第三，亞硝基化蛋白質還可進一步與自由巰基反應產生分子間二硫鍵和硝酰基(HNO)。化學反應式為:RSNO+RSH→RSSR+HNO［3］。綜上，亞硝基化可直接調節蛋白質功能，也可通過形成二硫鍵等與NO相關的巰基氧化修飾間接調節蛋白質的功能。

2 機體調節亞硝基化的機制

機體內存在一些酶可以對亞硝基化進行調節。目前研究比較多的酶主要有3種:一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)和亞硝基谷胱甘肽還原酶(S－nitrosogluthathione reductase，GSNOR)。其中Trx廣泛存在于各種哺乳動物細胞內，可以水解亞硝基化蛋白，引起去亞硝基化，維持細胞內亞硝基化穩態［4］。GSNOR可降解GSNO產生谷胱甘肽二硫鍵(GSSG)、N－羥基亞磺酰胺(GSNHOH)和銨離子(NH4+)，化學反應式為:GSNOGSNHOH+GSSG+NH4+。GSNOR基因敲除的小鼠體內亞硝基化水平明顯升高，證實了GSNOR在維持亞硝基化穩態方面的重要性［5］。此外，血漿銅藍蛋白和蛋白質二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase，PDI)也參與了亞硝基化作用［6，7］。目前還未發現特異性調節亞硝基化修飾的酶。

亞硝基化除了受酶調節外還與許多非酶因素有關。研究結果表明，在能被亞硝基化的蛋白質中只有少數蛋白質富含半胱氨酸，蛋白質中自由巰基過多或排列過度緊密，會影響單個巰基的亞硝基化［8］。堿性氨基酸和酸性氨基酸之間構成疏水環境，有利于蛋白質間的相互作用。研究證實，被亞硝基化的半胱氨酸主要存在于堿性氨基酸和酸性氨基酸之間［9］。有趣的是，在細胞內與NO合酶共定位的蛋白較其它蛋白更易發生亞硝基化［10］。此外，細胞內NO濃度、細胞的氧化還原狀態、蛋白所處的微環境也可以影響亞硝基化作用。

3 亞硝基化參與細胞信號轉導

3.1 亞硝基化對離子通道的調控 研究發現，心肌NOS產生的NO可使心肌細胞肌漿網膜上的雷諾丁受體鈣離子釋放通道(ryanodine receptor Ca2+release channel)亞硝基化，促進通道開放，增加胞漿內Ca2+濃度［11］。另有研究證實，海馬電壓門控式Ca2+通道發生亞硝基化后，Ca2+電流增加［12］。此外，鉀離子通道和鈉離子通道也可以發生亞硝基化修飾［13，14］。這些研究表明，亞硝基化修飾參與離子通道相關的生命活動如物質轉運、肌肉收縮、神經沖動傳遞等。

3.2 亞硝基化對膜受體功能的調節 G蛋白偶聯受體(G protein－coupled receptors，GPCRs)存在于所有的真核細胞中，是膜受體中最大的家族，可接受神經遞質、脂質介質及激素類物質等傳遞的信號，激活后生成第二信使，發揮生物學效應。研究發現，預先用NO供體GSNO孵育大鼠肺動脈可以使動脈組織α1腎上腺素能受體亞硝基化，與配體結合能力減弱，從而抑制兒茶酚胺誘導的血管收縮［15］。另有研究證實，NO供體硝普鈉處理HEK－293細胞可對血管緊張素受體進行亞硝基化，降低其配體與受體親和力［16］。GPCRs介導的信號通路可以產生 NO，相反NO可通過對GPCRs亞硝基化降低GPCRs與配體的親和力，抑制GPCRs介導的信號通路，形成負反饋調節環路，這對于調控GPCRs通路相關的細胞活動具有重要意義。受體酪氨酸激酶是膜受體的另一個大家族，這類受體所識別的信號蛋白統稱為生長因子。研究證實，表皮生長因子受體亞硝基化后與配體的親和力降低，表明亞硝基化具有抗細胞增殖作用［17］。磷酸化是GPCRs和受體酪氨酸激酶的主要調節機制，上述研究結果提示，亞硝基化是繼磷酸化之后調節GPCRs和酶偶聯受體的新機制。此外，還有其它膜受體如死亡受體和Toll樣受體等均可以發生亞硝基化［18，19］。

3.3 亞硝基化對激酶活性的影響 蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)廣泛分布于哺乳動物各器官、組織和細胞中，對細胞的代謝、生長、增殖和分化起著重要的調節作用。PKC的C1區包含1個富含半胱氨酸的“鋅指”結構，該區域內的半胱氨酸處于疏水環境易受巰基修飾劑的影響。Gopalakrishna等［20］證實，NO供體亞硝基化半胱氨酸(CyS－SNO)可抑制PKC磷酸轉移酶活性，NO清除劑或巰基還原劑可逆轉CyS－SNO的效應。絲裂原蛋白活化激酶(mitogen－activated protein MAP kinases，MAPK)家族包括細胞外信號調節激酶(extracellular－signal regulated kinase，ERK)、c－JUN 氨基末端激酶(c－Jun NH2－terminal kinase，JNK)和 p38MAPK。Park等［21］證實，低濃度NO可使JNK發生亞硝基化并抑制激酶活性，認為NO對JNK活性的抑制作用有利于機體抵抗紫外線、熱休克、DNA損傷物質的毒性作用。

3.4 亞硝基化對轉錄因子DNA結合活性的影響核因子 －κB(nuclear factor－κB，NF－κB)是一類存在于多種細胞，與炎癥和免疫應答相關的轉錄因子，它調控的基因表達產物主要包括致病因子和炎癥介質如NOS合酶、細胞因子、細胞因子受體以及黏附分子等，在炎癥反應的調控中起核心作用。Matthews等［22］發現，NO可對NF－κB的p50亞基進行亞硝基化，抑制p50的DNA結合活性。另有研究結果表明，亞硝基硫醇可通過阻止IκB降解或促進其mRNA轉錄發揮抑制NF－κB活性的作用［23］。活化蛋白－1(activator protein－1，AP－1)是第一個被發現的轉錄因子，參與細胞增殖和凋亡，在機體抵抗炎癥反應的過程中也發揮重要作用。Nikitovic等［24］證實，NO可對AP－1的亞基c－Jun第272位半胱氨酸和亞基c－Fos第154位半胱氨酸進行亞硝基化，改變AP－1的活性。cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element－binding protein，CREB)的活化是類風濕性關節炎滑膜組織增生過程中的關鍵環節，我室研究發現，NO可通過引起滑膜細胞內亞硝基化，導致CREB發生可逆性巰基氧化修飾，并抑制其DNA結合活性［25］。含有鋅指結構的轉錄因子對巰基氧化修飾具有敏感性，此類轉錄因子被亞硝基化可使鋅離子釋放，蛋白質變構。轉錄因子Sp1和早期生長反應因子作為含鋅指結構的轉錄因子分別在腫瘤細胞和血管平滑肌細胞增殖過程中發揮重要調控作用，研究證實，亞硝基化可使兩者的DNA結合活性降低，提示亞硝基化對于腫瘤細胞和血管平滑肌細胞增殖可能具有抑制作用［26］。缺氧誘導因子(hypoxia－inducible factors，HIF)在缺氧狀態下被激活，啟動一系列對缺氧敏感的基因的表達，參與缺氧反應。第533位半胱氨酸是NO對HIF活性調節的靶點，HIF亞硝基化可增強其活性，參與缺血條件下心肌保護［27］。越來越多的轉錄因子可以被亞硝基化修飾，提示亞硝基化在調控基因轉錄方面發揮關鍵作用，研究轉錄因子亞硝基化在疾病發生發展中的作用將為癌癥、炎癥等疾病的防治提供新的措施。

4 亞硝基化參與細胞凋亡

許多參與細胞凋亡的蛋白質都可以發生亞硝基化。Caspase－3是細胞凋亡的執行者，在生理狀態下，caspase－3發生亞硝基化活性降低，不能啟動凋亡;當凋亡信號傳入后使亞硝基的caspase－3去亞硝基化，誘導細胞凋亡［28］。B細胞淋巴瘤/白血病－2(B －cell lymphoma/leukemia－2，Bcl－2)蛋白是第一個被確認有抑制凋亡作用的蛋白，Bcl－2蛋白亞硝基化可增強其抗凋亡活性。相反，有些蛋白質發生亞硝基化后可促進細胞凋亡。例如，3－磷酸甘油醛脫氫酶亞硝基化可使其核轉位，誘導p53表達，促進細胞凋亡［29］。線粒體分裂蛋白－1亞硝基化可以誘導線粒體分裂，促進細胞凋亡［30］。綜上，亞硝基化對細胞凋亡具有雙向調節作用，這取決于細胞類型、細胞內的氧化還原狀態及NO的濃度。

5 亞硝基化參與炎癥反應

近年來亞硝基化的抗炎作用逐漸受到人們的重視。研究發現，在給小鼠應用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)之前吸入NO供體亞硝酸乙酯，可增加氣道組織亞硝基化蛋白質表達水平，抑制LPS誘導的NF－κB的活性并減輕肺臟炎性病理改變［31］。NO供體型非甾體抗炎藥(NO－NSAIDs)成為近年來抗炎藥物研究的重點。NO－NSAIDs可以直接抑制NF－κB活性或通過抑制 IκB降解阻礙 NF－κB活化［32，33］。此外，NO － NSAIDs可通過亞硝基化抑制半胱氨酸水解酶活性，減少IL－1、IL－6和TNF等炎性因子生成，抑制炎癥反應［34］。這些研究表明，亞硝基化具有重要的抗炎作用。

6 展望

亞硝基化正逐步被認為是一種與磷酸化相似的細胞信號轉導調控方式，但其反應特性、調控機制及生物學意義等方面都不十分清楚，均有待深入研究。隨著對蛋白質亞硝基化作用研究的不斷深入，人們對NO的生物學效應將有更加全新的認識，對氣體信號分子在細胞穩態快速調節中的作用有更深層次的了解。

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