兩種培養基對黃花蒿揮發油體外抑菌活性的研究

高志玲 樊 偉

（1 白城醫學高等專科學校，吉林 白城 137000；2 白城市第一中學，吉林 白城 137000）

黃花蒿（Artemisia annua L.），為一年生草本植物，在全國各省份均有分布，是一種傳統中草藥。用于暑邪發熱、陰虛發熱、夜熱早涼、骨蒸勞熱、瘧疾寒熱、濕熱黃疸等證[1]。黃花蒿的主要有效成分為青蒿素和揮發油等，過去的研究主要集中在青蒿素上[2]，對揮發油的研究很少。本實驗采用了普通營養培養基和抗生素實驗用的M-H培養基初步研究了黃花蒿揮發油的體外抑菌活性，以期為黃花蒿的綜合利用和天然食品防腐劑的開發提供參考，同時探討兩種不同培養基對中藥抑菌活性的檢測效果。

1 試驗材料

1.1 樣品來源

野生黃花蒿采自吉林省白城市近郊，經東北師范大學生命科學學院肖洪興教授鑒定為菊科植物（Artemisia annua L.）。

1.2 菌種來源

枯草桿菌（Bacillus subtilis）、四聯球菌（Micrococcus tetragenus）、變形桿菌（proteusbacillus vulgaris）、糞鏈球菌（Fecal streptococcus）均由白城醫學高等專科學校微生物實驗室提供。

1.3 儀器

BB89-2000揮發油提取器：北京中西泰安技術服務有限公司；AY220電子天平：日本島津公司；78-1型電熱恒溫培養箱：湖北省黃石市醫療器械廠；MLS3750型高壓蒸汽滅菌器：SANYO；YJ-875型醫用超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司。

2 方 法

2.1 黃花蒿揮發油的制備

取黃花蒿全草的鮮品，水蒸氣蒸餾法提取得到淡黃色油脂，即為黃花蒿揮發油。黃花蒿揮發油用吐溫80乳化，再溶解于一定體積的水中，配制成3.125～50.0mg/mL不同濃度的溶液，于冰箱中4℃保存備用。

2.2 培養基制備

①營養瓊脂培養基制備:稱取營養瓊脂22.5g加500mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，121℃高壓滅菌20min備用。②M-H瓊脂培養基制備:稱取16.5gM-H瓊脂加500mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，121℃高壓滅菌20min備用。

2.3 紙片法測定抑菌效果

用打孔器將干凈的濾紙制成直徑為0.5cm的小圓紙片，干熱滅菌后，分別浸入不同濃度的溶液中，使其充分吸收，備用。在超凈臺里用無菌的1mL移液管吸取菌懸液1滴置于倒好培養基的培養皿中央，涂布均勻。將浸泡處理過的濾紙片瀝干，貼在上述含菌平板上，每個平板貼3片相同黃花蒿揮發油濃度的濾紙片。吐溫80和無菌水的混合液作為空白對照，重復實驗2次。置于培養箱中37℃培養18h，測量抑菌圈的直徑。每個培養皿上的實驗結果取平均值。

2.4 試管法測定最低抑菌濃度（MIC）

根據濾紙片法所得的結果，參照文獻[3]，采用試管法對各受試菌種進行最低抑菌濃度測定（MIC）。兩種培養基分別以每管總體積5mL分裝于試管中，121℃，0.1Mpa條件下滅菌20min。當滅菌培養基冷卻至50℃左右時，加入黃花蒿揮發油，倍比稀釋成0.3125～20.0mg/mL梯度濃度，充分混勻，無菌水做對照，分別制成斜面。取生長良好的受試菌劃線接種于斜面上。置于37℃溫箱中培養，觀察24h菌落生長狀態。取完全不生長管最低樣品濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

3 結果與分析

3.1 不同質量濃度黃花蒿揮發油抑菌效果

用吐溫80和無菌水配制50.0mg/mL、25.0mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL的揮發油溶液，采用濾紙片擴散法測定黃花蒿揮發油在兩種培養基上的抑菌活性。實驗結果顯示黃花蒿揮發油對試驗菌均有明顯的抑制作用，隨著質量濃度的增大，抑菌效果均呈上升趨勢。在50.0mg/mL時，四聯球菌、糞鏈球菌、枯草桿菌、變形桿菌在普通培養基上的抑菌圈直徑分別是9.8mm、10.6mm、9.2mm、7.2mm，在M-H培養基上的抑菌圈直徑分別是10.5mm、11.3mm、10.8mm、8.5mm，黃花蒿揮發油對革蘭陽性菌（四聯球菌、糞鏈球菌和枯草桿菌）的生長有明顯的抑菌作用，對革蘭陰性菌（變形桿菌）的生長抑制作用相對較弱，其抑菌機制有待于進一步研究。

3.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定

用培養基配制20.0mg/mL、10.0mg/mL、5.0mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL的黃花蒿揮發油溶液，采用試管法測定樣品MIC，取完全不生長管最低樣品濃度作為最低抑菌濃度，結果顯示四聯球菌、糞鏈球菌和枯草桿菌在普通培養基上的MIC均為5mg/mL，在M-H培養基上的MIC均為2.5mg/mL，而變形桿菌在普通培養基上的MIC為10mg/mL，在M-H培養基上的MIC為5mg/mL，此實驗結果與濾紙片法結果相一致。

在相同試驗條件下，根據抑菌圈直徑大小和最低抑菌濃度可以判斷M-H瓊脂培養基對黃花蒿揮發油抑菌作用的檢測靈敏度高。中藥抗菌試驗一直用普通培養基，通過本試驗研究結果，建議今后在中藥抗菌試驗中采用M-H瓊脂培養基。

[1] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:人民衛生出版社,1985:166.

[2] 李偉,石崇榮.青蒿素研究進展[J].中國藥房,2003,14(2):118.

[3] 弭向輝,龔祝南,張衛明,等.花椒揮發油的提取、分離和抗菌實驗[J].南京師大學報,2004,27(4):63-66.