淋巴細胞微粒的形成及其活性

邱 倩, 趙 玲， 熊 瑋△

(1第三軍醫大學附屬西南醫院呼吸內科, 重慶 400038；2解放軍第十二醫院婦產科, 新疆 喀什 830000)

淋巴細胞微粒的形成及其活性

邱 倩1, 趙 玲2， 熊 瑋1△

(1第三軍醫大學附屬西南醫院呼吸內科, 重慶 400038；2解放軍第十二醫院婦產科, 新疆 喀什 830000)

淋巴細胞微粒； 免疫反應； 血管生成

淋巴細胞的主要生理功能是參與機體特異性的免疫應答及調節，可進一步分為T淋巴細胞、B淋巴細胞，分別執行細胞免疫功能和體液免疫功能。活化的淋巴細胞能夠表達和釋放多種細胞因子和蛋白等，同時，當淋巴細胞受刺激活化或凋亡時從漿膜上脫落成直徑為0.05-1.00 μm的小囊泡顆粒，形成淋巴細胞微粒(lymphocyte-derived microparticles, LMPs)。LMPs含有多種特異性膜糖蛋白和生物學活性的受體，可通過與靶細胞的相互作用啟動靶細胞的生物學效應。這些細小的微粒可通過調節一氧化氮(nitric oxide,NO)通路引起血管內皮細胞功能障礙。因此，在多種疾病中都可觀測LMPs數目的改變，如動脈粥樣硬化[1]、心肌缺血、糖尿病、先兆子癇[2]等。

1 細胞微粒的形成

目前對細胞微粒形成的認識主要限于體外分離或培養細胞的相關實驗，體內參與微粒形成的機制尚未明確。

生理狀況下，淋巴細胞可囊泡化產生少量的LMPs。但在疾病狀態下，LMPs數量的明顯增加，主要是淋巴細胞受激活劑活化或凋亡的結果。細胞膜骨架由肌動蛋白、肌球蛋白、肌鈣蛋白、紐蛋白和踝蛋白等組成，是保證細胞膜結構穩定性的主要物質。細胞膜骨架分解是微粒形成的前提，細胞膜出芽和膜骨架重構最終形成微粒，但細胞膜和膜骨架的相互作用機制仍在探討中 。

正常情況下，真核細胞的膜磷脂雙分子層分布不對稱。細胞膜外層主要由膽堿磷脂(鞘磷脂和卵磷脂)組成，而內層主要由氨基磷脂[磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)]組成。細胞通過消耗能量維持磷脂的不對稱分布，這一過程由細胞膜上3種特殊的能量依賴酶共同調節：氨基磷脂特異性移位酶(flippase)、非特異性脂質翻轉酶(floppase)和非特異性脂質爬行酶(scramblase)。前2種酶均為ATP依賴，后1種酶是Ca2+依賴。Flippase能迅速將PS和PE從細胞膜外層轉運到細胞膜內層；而floppase能緩慢將膜脂質從細胞膜內層轉運到細胞膜外層，scramblase允許膜脂質在膜磷脂雙層之間任意移動。在生理性Ca2+濃度下,活性的flippase和floppase共同維持膜脂不對稱分布的動態平衡,而scramblase處于失活狀態。當細胞受刺激活化或凋亡時，胞外Ca2+內流或胞內Ca2+儲存庫的釋放，使細胞溶質中的Ca2+濃度持續上升, floppase和scramblase被激活,而flippase活性則受到抑制，帶負電的PS翻轉暴露于細胞膜外層上，胞膜脂質雙分子層的不對稱分布被破壞。

而細胞膜磷脂不對稱分布消失常伴隨細胞膜出芽和脫落，形成分泌囊泡，出現微粒。這一過程被認為與PS外轉引起膜內外張力變化有關。實驗證明許多激活劑會破壞細胞膜磷脂質雙分子層的非對稱分布，導致微粒形成，如鈣離子載體C5b-9、鈣離子載體A23187、膠原和凝血酶。

此外，細胞活化或凋亡后，細胞溶質中Ca2+的濃度升高，并且呈現時間依賴。胞質中增加的Ca2+抑制磷酸酶，而激活鈣蛋白酶和蛋白激酶使踝蛋白降解，最終導致支撐細胞膜的正常細胞骨架結構遭到破壞，失去細胞骨架支撐的這部分細胞膜形成小泡狀結構而向外突出伸出偽足，變形脫落形成微粒。細胞外的Ca2+被乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)鰲合后阻斷胞質中Ca2+的增加和細胞骨架蛋白的降解，可阻止細胞釋放微粒。因此，胞質中Ca2+增加和細胞膜骨架降解是活化淋巴細胞釋放LMPs的主要機制。

但是研究發現，并不是所有的微粒都包含有PS，這說明微粒的形成機制非常復雜，可能有多條胞內通路[3,4]。Sebbagh等[5]發現半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)和Rho(Ras homologous member)相關的卷曲蛋白激酶Ⅰ(Rho-associated coil ed-coilprotein kinaseⅠ，ROCKⅠ)參與了微粒的形成。生理狀態下，Rho GTP酶類是細胞內調節細胞骨架肌動蛋白的信號分子，當其結合GTP后可向下游效應蛋白轉導信號。絲氨酸-蘇氨酸激酶的2種亞型(Rho相關的卷曲蛋白激酶Ⅰ、Ⅱ,ROCK Ⅰ、ROCK Ⅱ)被認為是Rho蛋白的效應器。ROCK蛋白被與GTP結合的Rho蛋白激活，促進肌球蛋白輕鏈的磷酸化，肌球蛋白ATP酶激活使肌球蛋白-肌動蛋白絲與細胞質膜連接，收縮力增加，細胞收縮[6]。而細胞凋亡時囊泡的形成與Rho蛋白無關，取決于ROCK。ROCK Ⅰ被caspase-3激活發揮細胞收縮效應，導致了細胞膜骨架結構紊亂[7]。因此，凋亡時微粒形成中ROCK Ⅰ和caspase-3共同參與介導了細胞膜骨架結構的重塑。

而細胞活化和凋亡釋放的微粒，不但形成機制上不同，在大小、膜磷脂與蛋白質的組成以及生理功能上也有明顯差異[8]；體內微粒的釋放水平具有性別特異性，受月經周期[9]和晝夜節律的調節[10]。而體內和體外產生的微粒表型有差異，細節未明。

2 LMPs的組成及表面標記

LMPs反映來源細胞的狀態(至少在體外)，帶有淋巴細胞胞漿內容物和其表面標記。從血液中分離的微粒(包括LMPs)由60%的磷酸卵磷脂、20%的鞘磷脂、9%的PE和其余一些磷脂組成。但不是所有的微粒表面都含有PE和PS[11]。使用不同方法得到的LMPs，其成分和表面標記可有差異。雖然Miguet等[12]使用1-D聯合LC-MS/MS的方法首次分析了T細胞來源的LMPs的蛋白組成，結果鑒定出390種蛋白，其中34%定位在質膜上，含有17種不同分化的造血集群。但是LMPs的化學組成仍然缺乏描述。同時，LMPs的蛋白組成也取決于親代淋巴細胞活化的方式。通過T細胞受體激活的T細胞富含CD3ε和CD3ξ鏈，其釋放的微粒也含有此表面標記，而伊屋諾霉素和鹽酸甲氧激活產生的LMPs則沒有[13]。一般來說，LMPs表面表達淋巴細胞膜表面抗原，主要是糖蛋白，如CD3、CD4、CD8和CD20[14]。但并不是LMPs能表達所有來源的細胞蛋白。例如：T細胞來源的LMPs并不表達CD28和CD45。

3 LMPs的生物學活性

LMPs作為細胞間傳遞生物信息的重要介質，有多種生物學活性，可作為細胞介質和促進細胞信號的轉導和效能。

3.1調節免疫反應 LMPs可對巨噬細胞起作用，調節免疫反應。深入研究發現，來源于Jurket T細胞株能釋放LMPs，LMPs被RAW264.7巨噬細胞吞噬，進而誘導RAW264.7巨噬細胞凋亡，凋亡過程釋放微粒，導致微粒數目進一步增加。這一過程是通過磷脂-花生四烯酸脂質途徑實現的[15,16]。體外和體內研究已證實巨噬細胞對死亡和瀕臨死亡細胞的吞噬具有高效性。不同于壞死細胞被攝取后出現的病理過程，大量凋亡細胞被吞噬可抑制炎癥反應引發抗炎效應[17]。而巨噬細胞可通過攝取繼發壞死的細胞自身得到活化，從而分泌炎癥介質，因此，如果大量凋亡的細胞不被及時清除出現繼發性壞死時，將啟動機體炎癥應答引起炎癥反應。

事實上，在一些自身免疫性病和慢性炎癥疾病中就存在著對凋亡細胞吞噬的缺陷，而巨噬細胞的大量凋亡將進一步促進炎癥的發生。最終，釋放的LMPs導致了免疫抑制和微粒的自我擴增，引起機體的炎癥狀態反應。這說明微粒可作為一種新的炎癥介質，微粒的釋放和生物學活性為研究免疫調節提供了一種新思路。

促/抗炎因子的不平衡狀態在慢性炎癥疾病如多發性硬化癥和類風濕性關節炎的病理發展中起重要作用。T細胞通過與人類單核巨噬細胞直接接觸產生病理效應，包括介導促炎因子白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)的上調，誘發慢性炎癥;正常情況下，這種病理過程可被HDL相關的載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)特異性抑制。除了促炎因子外，通過直接接觸激活的單核細胞也介導細胞因子抑制物的產生，如分泌型白細胞介素1受體抑制物(secretory interleukin 1 receptor antagonist protein，SIL-IRα)。同時，LMPs也可促進多種炎性介質釋放與黏附分子表達，從而促進炎癥反應。Scanu等[18]體外刺激T細胞產生LMPs，LMPs同樣也可誘導人類單核細胞產生IL-1β、TNF和SIL-IRα，HDL可抑制IL-1β和TNF的產生，但對SIL-IRα無此作用，說明了HDL在LMPs非壞死性活化單核細胞上具有抗炎作用。T細胞激活后釋放LMPs轉移來源細胞表面分子，以細胞接觸的方式參與單核細胞的活化，從而影響單核細胞的活性，這種活性不是通過在炎癥位點與T細胞直接接觸的形式獲得的。

3.2調節血管張力 血管壁不是一個靜止的器官，在生理或病理刺激下發生動態變化。血管壁主要由平滑肌細胞、內皮細胞和細胞外基質組成。許多全身及局部因子調節血管平滑肌細胞和內皮細胞的功能，影響這些細胞的反應性，進而調節血管反應性。收縮因子包括血管活性肽、血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、內皮素-1，刺激血管增生及收縮，提升血壓；舒張血管因子：NO、前列環素(prostacyclin,PGI)、C型利鈉肽和內皮源性超極化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor,EDHF)使血管擴張，從而降低血壓 。而在微粒作用下血管的擴張程度將下降。LMPs可改變NO和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產生與釋放之間的平衡導致血管壁氧化應激增加，影響內皮細胞功能，誘導內皮功能失調[19]。Martin等[20]實驗證明LMPs可減弱乙酰膽堿誘導的血管舒張，減少小鼠主動脈環NO的釋放，增加其過氧化物的產生，這些效應具有時間依賴性；同時證明LMPs也可下調剪切力介導的內皮依賴性小鼠腸系膜小動脈的舒張功能。其作用都是通過LMPs下調內皮細胞一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和上調小窩蛋白(caveolin-1)的表達而抑制內皮細胞NO與PGI的合成,從而上調了血管張力[20]。

除此之外，LMPs還可直接作用于平滑肌細胞而影響血管收縮功能。此微粒通過Fas配體(Fas ligand,FasL)與平滑肌細胞上的Fas相結合，激活平滑肌細胞NF-κB，活化eNOS及環氧合酶-2(COX-2)，促進NO和PGI的生成，進而誘導鼠主動脈弓對血管擴張劑的低反應性和內皮細胞功能紊亂。

3.3調節血管生成 最近幾年的研究發現微粒通過在細胞間傳遞生物信息來調節心血管系統的功能。由于產生LMPs的方式不同，LMPs在調節血管生成方面有抑制和促進雙重效應。

① 抑制血管生成 Yang等[21]發現體外經放線菌D處理后產生的LMPs能強烈地抑制主動脈環毛細血管的萌芽，阻礙毛細血管樣結構的形成，使血管增殖、遷移和修復受損。該作用與下調2型血管內皮生長因子受體和提高ROS產物有關。進一步研究發現，LMPs使NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)亞基gp91phox、p22phox和p47phox的表達增加，結果導致ROS和NOX衍生的超氧化物(O2-)生成增多，而ROS參與了損傷內皮細胞功能；同時，LMPs使受體CD36的抗血管生成蛋白表達顯著增強，并下調了2型血管內皮生長因子受體及其下游信號轉導的蛋白質(磷酸化ERK1/2)的水平，從而抑制了血管生成。Mostefai等[19]研究表明,LMPs通過PI3K途徑降低NO的產生。培養的內皮細胞受這種微粒的處理后,NO產生減少,該效應與eNOS的抑制位點磷酸化增強和caveolin-1的過表達有關。NO在血管生成過程中發揮著重要的作用,其調節血管內皮生長因子介導的血管生成。LMPs使內皮細胞NO產生減少,最終導致血管生成受損。

因此，體外經放線菌素D處理后產生的LMPs通過PI3K激酶、黃質氧化酶和NADPH氧化酶途徑激活內皮細胞通路與ROS和NO有關，ROS和NO共同參與了LMPs抑制血管生成方面的作用。

② 促進血管生成 最近研究發現激活或凋亡的人淋巴細胞產生的LMPs也能夠增加促血管生成因子的表達如:血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、IL-1β以及細胞黏附分子(ICAM-1),促進血管生成[22]。Martinez等[23]證實了激活或凋亡的人淋巴細胞產生的LMPs表面攜帶有(sonic hedgehog,Shh)基因。Shh基因在脊椎動物胚胎組織形成中起著重要的作用，包括大腦、脊椎、中軸骨骼和四肢的形成[24]。Shh蛋白被證實是脊椎動物發育過程中組織形成所必需的胞外信號[25]，并能誘導巨核細胞的分化[23]。攜帶Shh基因的LMPs直接作用于內皮細胞，改善內皮細胞的功能，并通過直接激活Shh和PI3K通路使內皮細胞釋放NO,介導局部缺血/再灌注來預防內皮細胞功能障礙的發生。此過程與NO通路有關的酶磷酸化使其表達發生改變和降低了ROS有關[26]；另外，Shh蛋白通過上調促血管生成因子家族的兩大家族：VEGF和血管成形素間接促進血管生成。Soleti等[22]在體外用LMPs(Shh+)處理血管生成模型中的內皮細胞發現，微粒介導和增加了毛細血管樣組織的形成,并且這些微粒調節細胞的增殖、黏附分子的表達和內皮細胞的遷移。q-PCR結果顯示促血管生成因子：VEGF、肝細胞生長因子受體(hepatocyte growth factor receptor,HGF)和FLT-1的mRNA表達水平增加。通過連接后肢缺血小鼠的左股總動脈，發現LMPs(Shh+)通過激活eNOS和其它下游的促血管生成因子增加了小鼠后肢的血流灌注。這說明微粒(Shh+)在刺激新生血管生成方面發揮著有效的作用。

總之，刺激生成的方式不同，LMPs在調節血管生成方面發揮著不同的作用。如：放射菌素D、植物凝集素(PHA)等刺激和凋亡產生的LMPs作用不一致。濃度也可影響LMPs調節血管生成的作用。低濃度的LMPs可能促進血管生成，高濃度的LMPs可能起抑制作用。LMPs的促血管生成作用和其促進內皮細胞釋放NO有關，而抗血管生成作用和氧化應激及降低了內皮細胞釋放NO有關。

4 LMPs和臨床疾病

4.1心血管疾病 LMPs在冠心病的發病機理中起著重要的作用，研究發現動脈粥樣斑塊中有LMPs的存在[1]。來源于心肌梗死體內的微粒可損傷內皮NO轉導通路，說明微粒可能部分參與了這些患者存在的內皮功能失調的過程[27]。心肌梗死的新治療方法就是通過降低缺血/再灌注損傷的負面影響，來防止壞死梗塞區的擴大并促進新生血管形成。動物模型實驗表明建立側支循環可達到這一目的。把生長因子直接注入缺血區域或把帶有VEGF的質粒載體轉入動脈可促進側枝血管的形成[28]。實驗表明靜脈注射激活或凋亡的人淋巴細胞產生的LMPs(Shh+)可釋放NO，從而改善內皮細胞功能。最近報道了Shh基因治療可作為一種有效的治療手段用來改善缺血或心梗模型的心肌功能，并能促進糖尿病傷口愈合[29]。因此，攜帶Shh的LMPs可作為一種不同于基因治療的新的治療方法，通過改善內皮細胞功能、促進新生血管形成干預心血管病病程。

4.2類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA) Combes等[30]首次指出微粒可能在RA中的作用與血栓形成有關。但是微粒的數目和疾病活動的關系尚不確定。盡管研究者使用相同的方法分離和鑒定微粒，但由于分組不同，患者存在著個體差異，不同的研究結果中患者體內微粒的來源及數目有較大變化。

Berckmans等[31]發現和其它類型的關節炎患者和健康對照組相比，RA患者血液中LMPs、單核細胞微粒、粒細胞微粒和紅細胞微粒的水平均無顯著差異，而關節腔滑液中微粒增高。其中T細胞來源的微粒、B細胞來源的微粒分別占微粒總數的20%-25%和低于10%。在一些患者的關節腔滑液的微粒中檢測到組織因子，微粒通過因子Ⅶ依賴的機制誘導凝血酶形成，可能進一步促進了關節內纖維素的沉積。另一方面，微粒在RA中的活性與微粒對成纖維細胞的作用有關。Distler等[32]發現來源于Jurkat細胞的LMPs可以劑量依賴的方式誘導滑液中成纖維細胞MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白的合成(高達80倍)，而MMP-2、MMP-14、組織蛋白酶、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1、TIMP-2和TIMP-3則無改變，說明LMPs對成纖維細胞MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13的上調具有特異性。同時，LMPs也可刺激促炎因子IL-6、IL-8、MCP-1和MCP-2的合成釋放。這些細胞因子可吸引更多的炎癥細胞遷移到關節內并激活微粒本身，導致更多的微粒釋放，進一步反饋活化炎癥細胞使炎癥出現自我放大反應，導致骨和軟骨的破壞。微粒激活成纖維細胞的具體機制未明，由于一些微粒包含核苷酸和其它核內分子，可能TLR參與了激活過程。通過IκB轉染成纖維細胞和電遷移率分析，證實微粒誘導MMP的生成依賴于NF-κB通路，但與TNF-α和IL-1無關，表明LMPs誘導MMP和細胞因子釋放可能與患者對生物靶向TNF-α和IL-1治療的抵抗有關。

4.3糖尿病 目前威脅糖尿病病人生命最嚴重的病理為心血管病變，累及各種大血管和微血管病變是造成Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病發病和致死的主要原因。微血管病變常伴有微循環異常，引起腎臟病變、眼底病變等，嚴重者可造成腎功能衰竭和失明，是決定患者預后的主要因素,常見于各型糖尿病；而大血管病變主要和動脈粥樣硬化、高血壓、血脂障礙和肥胖等危險因素有關，常引起心、腦、腎嚴重并發癥而致死，因此在2型糖尿病更常見。現已檢測到糖尿病患者體內總微粒數量(包括LMPs)有明顯增加[33]。和對照組相比,患者體內總Annexin-V陽性的微粒(包括LMPs)數量顯著上升，且HbA1c相關微粒的凝血活性也顯著增強，HbA1c參與了1型糖尿病糖蛋白失衡的病程。而2型糖尿病僅見總Annexin-V陽性的微粒增加。除了血凝素受體外，微粒表面還可攜帶黏附分子以結合血細胞或血管內皮，參與炎癥信息的傳遞。白細胞來源的微粒可與內皮細胞相互作用誘導組織因子的表達。這說明各型糖尿病病理過程中激活釋放微粒，反作用于血細胞和血管內皮細胞，加重細胞活化過程，惡化血管病變和疾病病程。

4.4其它 在其它各種生理和病理狀態都可有過量的微粒生成。如：細胞黏附、細胞凋亡、炎癥反應、癌癥、感染和正常或異常妊娠等。炎癥狀態下，體內微粒的釋放量增加[34]。同損傷的細胞類似，微粒也能通過激活補體級聯反應來啟動炎癥過程。識別單位C1q可結合來自凋亡Jurkat T細胞的LMPs，從而活化補體經典途徑[35]。MPs表面有C3、C4的沉淀物可證實這一點。體內檢測人類血漿中C1q陽性微粒量也同樣可證明。補體經典途徑早期成分的沉積能激活經典途徑促進炎癥反應。同時，在刺激炎癥反應的機制中，微粒能釋放花生四烯酸作用于靶細胞，增強炎癥細胞的趨化性，并可誘導炎癥因子的形成。LMPs也可通過誘導免疫活性細胞凋亡來發揮抗炎作用。Jodo等[36]發現細胞能釋放表面攜帶FasL的微粒。與可溶性FasL和弱細胞毒性介質有關不同，微粒相關的的FasL的作用類似于殺傷性B細胞、T細胞的FasL的作用。已證實T細胞來源的LMPs能誘導Raw264.7巨噬細胞凋亡，并促進凋亡中的巨噬細胞釋放微粒[15]。這種促凋亡機制和炎癥反應密切相關。但在惡性腫瘤中，來源于腫瘤細胞并攜帶FasL的微粒誘導殺傷性T細胞凋亡可導致腫瘤逃逸。HIV-1感染患者外周血液中也有來源于輔助T細胞的微粒的增加。

5 小結

LMPs作為淋巴細胞受刺激活化或凋亡后形成的細胞脫落物，循環血液中LMPs水平和性質可反映其來源淋巴細胞的功能狀態，并發揮多種重要的生物學作用，參與許多臨床疾病的病理生理過程，因此對LMPs的形成過程、產生機制、內部成分及其生物學活性的作用機制等的進一步研究都將成為今后深入探討的熱點。LMPs作為淋巴細胞活化或凋亡的標志物，如何將LMPs的各種作用運用于臨床等都有待進一步解決。

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Formationandactivityoflymphocyte-derivedmicroparticles

QIU Qian1, ZHAO Ling2, XIONG Wei1

(1RespirationDepartmentofSouthwestHospitalAffiliatedtoTheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China;2DepartmentofObstetricsandGynecology,TheTwelfthHospitalofPLA,Kashi830000,China.E-mail:xiongwei64@126.com)

Lymphocyte-derived microparticles (LMPs) are small membrane vesicles that are released upon activation or during apoptosis from lymphocytes.The LMPs were detected at elevated levels in the patients with inflammatory diseases, cardiovascular diseases or diabetes. In addition, LMPs are important mediators of transferring biological information and switching on the biological effects through their interaction with the target cells. Moreover, LMPs play completely distinct roles in different physiological and pathological conditions. This article describes the possible mechanism involved in the formation, composition, key biological activities and the relationship with diseases.

Lymphocyte-derived microparticles; Immune response; Angiogenesis

1000-4718(2011)04-0817-06

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.039

2010-07-19

2010-11-30

△通訊作者 Tel:023-68765316; E-mail: xiongwei64@126.com