ClC－3氯通道蛋白磷酸化及其功能的研究進展*

柏志全， 李華榮， 張海峰， 朱林燕， 王立偉△， 陳麗新△

(暨南大學醫學院1生理學系，2藥理學系，廣東廣州510632)

細胞容積調節廣泛參與細胞的各種生理病理過程，如上皮細胞物質轉運、物質代謝、細胞興奮性、激素釋放、細胞遷移、細胞增殖及細胞壞死凋亡等［1，2］。在低滲環境刺激下，容積激活性氯通道參與細胞容積調節，對維持細胞容積起著重要調節作用。目前，普遍認為容積激活性氯通道的候選蛋白是電壓門控氯通道家族蛋白成員3［voltage－gated chloride channel(ClC)family protein 3，ClC－3］。ClC－3氯通道分布廣泛，各種組織器官和細胞中都有表達，并且具有較高基礎活性，通道開放，Cl－外流形成氯電流，參與細胞容積調節、介導物質跨膜轉運、胞內有機物釋放及突觸囊泡酸化等過程。不同生理病理過程中，各種刺激信號通過各自的信號通路轉導或者直接刺激氯通道，導致通道開放或者關閉，說明ClC－3氯通道門控特性是由多種機制參與調節。那么，研究ClC－3門控調節機制對理解其在多種生理病理過程的作用成為關鍵點。

磷酸化和去磷酸化是蛋白質功能調節的重要機制之一，通過磷酸化或去磷酸化使該蛋白激活或者失活從而影響其功能。研究發現，多種蛋白激酶參與了ClC－3氯通道的開放或關閉過程。因此，探討不同蛋白激酶對ClC－3氯通道的調節，從而推斷其在不同生理病理過程中的作用具有重要意義。本文將討論ClC－3氯通道相關蛋白激酶及其對ClC－3氯通道功能調節作用。

1 ClC－3氯通道及蛋白磷酸化

1.1 ClC－3氯通道 ClC－3氯通道蛋白是電壓門控氯離子通道ClC家族成員之一，該蛋白與ClC－4及ClC－5兩種氯離子轉運體氨基酸序列相近。位于常染色體4q33區的CLCN3基因，編碼ClC－3蛋白，ClC－3氯通道有2種亞型:其一，Transcript variant e(NM_173872.2)翻譯的ClC－3e蛋白全長866個氨基酸;其二，Transcript variant b(NM_001829.2)翻譯的ClC－3b蛋白全長818個氨基酸，ClC－3b在羧基末端較ClC－3e少48個氨基酸。

ClC－3由Sasaki等［3］在大鼠腎臟克隆并鑒定，隨后研究發現該蛋白分布廣泛，在不同種屬的不同組織器官和細胞都有表達。ClC－3蛋白不僅分布在細胞膜上，同時在胞漿和細胞核內都有分布［4，5］。對其通道特性、生理功能研究時發現ClC－3氯通道可以調節細胞多種功能，參與到各種生理病理過程中，其開放或關閉受多種因素調節，如氯離子濃度、滲透壓、pH、膜電位、ATP、鈣離子及蛋白激酶等。其中，已發現可以影響通道開放關閉的蛋白激酶如PKA (protein kinase A)、PKB、PKC等是各種信號通路中的關鍵蛋白激酶，可磷酸化下游蛋白使其行使功能。不同刺激信號作用細胞后通過第二信使或第三信使激活這些蛋白激酶，它們通過對ClC－3氯通道的磷酸化影響其功能，如cAMP→PKA→ClC－3。因此，ClC－3氯通道在不同生理病理過程中的功能受多種信號通路調節控制。

1.2 蛋白質磷酸化 可逆性磷酸化是蛋白質功能調節的重要機制，蛋白激酶和磷酸酶通過磷酸化或去磷酸化調節蛋白質功能，參與調控細胞信號轉導、基因轉錄翻譯、細胞周期等過程。細胞生命關鍵活動都有蛋白激酶介導磷酸化修飾參與，其中蛋白質可逆性磷酸化是細胞信號轉導的重要方式。

真核生物蛋白質的磷酸化位點主要是絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸殘基，而原核生物蛋白質磷酸化多發生在組氨酸、精氨酸和賴氨酸殘基。一種蛋白質可能存在多個磷酸化位點并受多種蛋白激酶和磷酸酶調控，因此對蛋白質磷酸化研究就比較復雜。蛋白質磷酸化研究包括磷酸化類型、磷酸化位點預測及鑒定、磷酸化定量分析、磷酸化功能研究、磷酸化調控信號通路研究等。

2 ClC－3氯通道磷酸化及其功能

ClC－3氯通道在低滲環境下被激活，通道開放，參與細胞多種生理調節過程，在細胞容積調節中具有重要作用。多年研究發現，不僅低滲可以激活ClC－3氯通道，其它多種胞內或胞外刺激信號都可以使通道開放或者關閉。這些信號如何激活或關閉ClC－3氯通道是多年來的研究熱點。以下將主要討論磷酸化對通道開關的影響及其意義。

2.1 PKA信號通路 ClC－3、ClC－4和ClC－5屬于ClC家族同一分支，ClC－5首次從大鼠腦克隆并鑒定，其80%氨基酸序列與ClC－3相同，并證實有PKA的磷酸化位點，然而人為提高細胞內cAMP濃度對其電流特性沒有影響［6］。PKA激動劑forskolin可以明顯激活小鼠睪丸細管中未成熟足細胞TM4的氯電流，其抑制劑H－89則能消除1，25(OH)2－D3激活的氯電流［7］。Nagasaki等［8］較為詳細研究了胞內cAMP對ClC－3的作用，結果顯示8－BrcAMP可以抑制豚鼠心肌細胞低滲激活ClC－3電流;異丙腎上腺素在無鈣條件下可以減低ClC－3電流;高表達ClC－3氯通道的NIH/3T3細胞，8－BrcAMP可抑制ClC－3電流，其效應可被PKA拮抗劑KT5720和ClC－3突變(S51A)阻斷，提示cAMP通過PKA磷酸化S51(PKC磷酸化位點)位絲氨酸抑制ClC－3電流。但PKA是否確實通過磷酸化S51而影響ClC－3通道還有待于進一步證實，其主要原因有兩點:第一，cAMP對ClC－5沒有影響;其二，研究發現某些ClC－3突變體可以降低對氯離子通透性，其特性同ClC－5對氯離子的轉運相似［9］，由此可推斷該突變點附近可能存在PKA磷酸化位點。

G蛋白偶聯受體→cAMP→PKA信號轉導通路是經典激素信號轉導通路，ClC－3通道可能是PKA效應蛋白之一。正如上文所述異丙腎上腺素作用于腎上腺受體后，激活腺苷酸環化酶導致cAMP濃度升高，活化的PKA磷酸化ClC－3通道影響細胞功能。cAMP→PKA信號轉導通路不僅影響ClC－3通道，同時也影響其它陽離子通道如鉀離子通道［10，11］，共同調節細胞容積維持內環境穩態。

2.2 Akt(PKB)信號通路 磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)家族參與多種信號通路，該酶可使磷脂酰肌醇的3位磷酸化而生成PI－(3，4)P2和PI－(3，4，5)P3。其中，IA型PI3K磷酸化磷脂酰肌醇形成的磷脂酰肌醇三磷酸酯(phosphatidylinositol 3，4，5－trisphosphate，PIP3)可調節下游Akt/PKB活性，該信號通路與腫瘤發生發展密切相關而備受關注［12，13］。活化的Akt/PKB通過磷酸化下游許多靶蛋白如GSK－3β、Bad、caspase－9、NF－κB、CREB、p21Cip1和p27Kip1等，調節細胞多種活動如遷移、增殖和分化等。

ClC－3氯通道參與細胞多種功能，研究發現其在細胞遷移過程中具有重要作用。Wnt通路是介導細胞遷移的主要信號通路，其中GSK－3β是該信號轉導通路中關鍵蛋白激酶，GSK－3β同樣也是Akt/ PKB信號通路的下游蛋白［14］，那么ClC－3氯通道是否作為這些信號通路的最終效應蛋白從而影響細胞遷移。目前沒有直接證據說明PKB和GSK－3β影響ClC－3氯通道的報道。Tang等［15，16］在研究內皮素對大鼠基底血管平滑肌增殖時發現，利用siRNA干擾阻斷ClC－3表達后，PKB和GSK－3β的磷酸化程度明顯減弱。該結果可推測ClC－3氯通道可能是PKB或GSK－3β信號通路中的參與者。因此，細胞外刺激信號是否通過PKB或GSK－3β信號通路影響ClC－3氯通道從而調節細胞功能還有待于進一步證實。

2.3 PKC信號通路 1994年，Kawasaki等［17］從大鼠腦神經元克隆出ClC－3基因，研究發現活化的PKC可以抑制ClC－3氯通道。此后，科學家對PKC調節ClC－3氯通道功能進行了大量研究。目前對于PKC調節ClC－3氯通道有兩種相反的觀點，一種是PKC抑制ClC－3氯通道開放，一種是PKC激活ClC－3氯通道。Du等［18］研究犬科動物心房肌細胞容積激活性氯通道時發現活化的PKC可以激活ClC－3通道，其研究結果同PKC抑制兔心房肌細胞ClC－3通道相反，認為這是由于種屬差異引起的。Gong等［19］在研究PKC對小鼠心室肌細胞容積激活性氯通道影響中得出的結論與上述Du等［18］研究結果相同，即活化的PKC可以激活ClC－3通道。目前，多數實驗數據提示活化的PKC抑制ClC－3，如Duan等［20］、Boese等［21］、Do等［22］等科學家研究結果表明PKC抑制ClC－3。

PKC通過磷酸化ClC－3氯通道起調節作用，那么就需要確定其磷酸化位點。Duan等［20］利用位點突變技術，發現51位絲氨酸可能是PKC磷酸化作用位點，其它科學家利用膜片鉗技術研究了51位絲氨酸突變體ClC－3電流特性，發現PKC不能抑制突變體ClC－3。該研究小組的Rossow等［23］利用缺失突變技術研究了ClC－3氨基末端前100個氨基酸對通道門控影響，發現缺失型ClC－3氯通道對PKC沒有反應，而胞內透析磷酸化片段肽(氨基末端12－61位序列)可以明顯抑制缺失型ClC－3氯通道電流。這些實驗結果說明51位絲氨酸是PKC磷酸化作用潛在位點。

PKC參與的信號通路對生物體影響廣泛，在膜離子轉運、機體代謝、基因表達、細胞分化和增殖等起重要調節作用［24］。PKC受多種第二信使調節，并且有多達12種同工酶，這就注定以PKC為中心的信號通路十分復雜。ClC－3氯通道作為PKC下游的一種效應蛋白，可能受不同信號通路和不同亞型PKC調節，所以就不難理解PKC對ClC－3氯通道調節具有顯著差異。

2.4 鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶 II(calcium calmodulin kinase II，CaMKII)信號通路 鈣離子具有十分重要的生理意義，不僅可做為第二信使參與鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶等信號通路轉導，同時可作為某些蛋白的直接調節因子起作用，如參與肌纖維細胞收縮、囊泡分泌等。鈣/鈣調蛋白可激活信號通路下游多種效應物如質膜和肌漿網鈣通道、鈣調蛋白依賴性蛋白激酶、磷酸化酶激酶、環化酶、NO合酶等，各種活化的效應物質又可作用于下游的效應蛋白，共同調節細胞各種生理病理過程。信號通路中關鍵激酶CaMKII的底物譜非常廣泛，研究證實該激酶可以磷酸化ClC－3通道蛋白［25，26］。

Robinson等［27］對CaMKII調節ClC－3進行了較系統的研究，對tsA、T84、HT29以及平滑肌細胞研究發現:CaMKII可以激活ClC－3通道，氨基末端109位絲氨酸可能是CaMKII調控ClC－3通道的作用位點。血小板激活因子(platelet－activating factor，PAF)參與炎癥介質引起的腸損傷，Claud等［28］發現PAF對腸上皮細胞具有直接病理作用，PAF可激活ClC－3氯通道引起細胞內酸化繼而細胞發生凋亡，PAF激活的氯電流可被鈣螯合劑或CaMKII抑制劑阻斷，說明PAF介導的細胞凋亡是通過CaMKII激活ClC－3氯通道導致細胞內酸化而引起。

ClC－3氯通道蛋白不僅分布在細胞膜上，同時在胞漿和細胞核內都有分布，那么ClC－3蛋白是如何在細胞內移動。Huang等［25］在研究 CaMKII對ClC－3作用時發現，提高細胞內鈣離子濃度可以促使ClC－3從胞漿向胞膜移位。目前，鈣和CaMKII對ClC－3的調節機制研究還不清楚，尚待進一步研究。

2.5 SGK信號通路 血清和糖皮質激素調節蛋白激酶(serum and glucocorticoid－regulated kinase，SGK)是Ser/Thr蛋白激酶，作為多種細胞信號轉導通路和細胞磷酸化級聯反應的一個功能性交匯點，可通過影響鈉、鉀離子跨膜轉運調節多種細胞容積、細胞增殖等，其對快速轉錄水平的調節具有重要作用［29，30］。此外 Wang等［31］報道 SGK能間接激活ClC－3氯通道從而調節細胞容積。

3 小結

增殖、分化、凋亡、遷移、分泌等細胞行為過程中都有細胞容積改變，而參與細胞容積調節過程具有多種因素如鈉離子、鉀離子、鈣離子、氯離子、細胞骨架蛋白等。容積激活性氯通道ClC－3調節氯離子跨膜轉運，對細胞容積調節具有重要作用。細胞容積不斷變化但處于相對穩定狀態，而細胞在接受內外刺激信號后，如何通過ClC－3調節細胞容積以適應內外環境是研究其容積調節作用的關鍵內容。多年研究證實多種內外刺激信號可通過不同信號通路激活的蛋白激酶磷酸化ClC－3影響其功能。因此，研究不同蛋白激酶對ClC－3功能影響并尋找其作用位點，針對這些作用位點開發藥物從而阻斷某一信號通路干預細胞特定行為，對于研究和治療包括高血壓、心臟病、腫瘤等多種疾病具有參考意義。

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