MicroRNA與膀胱癌的研究進展

蔣海鋒 綜述 薄雋杰 審校

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院泌尿外科，上海 200127

膀胱癌是一個重要的公共問題，在世界范圍內，膀胱癌的發病率居惡性腫瘤的第九位，是我國泌尿系統最常見的惡性腫瘤，其中90%以上為膀胱移行細胞癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)［1-2］。膀胱鏡檢查及尿脫落細胞學檢測仍是當前診斷膀胱癌不可替代的金標準，由于膀胱鏡檢查會帶給患者創傷和昂貴的檢測費用，而細胞學檢查的敏感性低。因此，膀胱癌的分子生物學研究日益受到國內外學者的重視，希望從分子水平上揭示膀胱癌的發生、發展、轉移及轉歸，從而提高膀胱癌的診治水平。近年來的研究表明，多種微小RNA(MicroRNA，miRNA)參與了腫瘤細胞的生物調控過程，間接地起著原癌基因和抑癌基因的功能，在腫瘤的發生和發展中起了至關重要的作用［3］。

1 miRNA介紹

miRNA是一種小的內源性非編碼RNA分子，大約由19～25個核苷酸(nucleotide，nt)組成，平均為22個nt［4］。這些小的miRNA通常靶向一個或者多個mRNA，通過與靶mRNA特異的堿基配對引起靶mRNA的降解或翻譯抑制，在轉錄后水平調控基因表達，從而起著調控細胞分化、生長、增殖、代謝和凋亡等功能［5］。

1.1 miRNA的合成

首先，miRNA基因產生的初級產物(primiRNA)在核內被RNA酶Ⅲ Drosha-DGCR 8(Disgorge syndrome critical region8)復合體所切割，形成約由60～70個核苷酸組成的、具有發夾結構的miRNA前體(precursor microRNA，premiRNA)。然后，迅速被Ran-GTP依賴的轉運蛋白Exportin-5轉運至細胞質。最后，在細胞質內經Dicer酶切割形成約22 nt的雙鏈RNA片段，隨后被整合至RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中形成RISC-miRNA復合體，其中一條鏈降解，另一條生成成熟的miRNA保留在復合體中。RISC-miRNA復合體與靶mRNA完全或不完全匹配，調控靶mRNA降解或阻遏其轉錄后翻譯，影響蛋白質的合成，從而調節細胞增殖、分化與凋亡，參與個體發育、機體代謝以及腫瘤發生、發展等過程［6-7］。

1.2 miRNA的功能

人體內大約含有1 000種miRNA，但卻調控著大約30%的mRNA翻譯。正常組織中，miRNA正常轉錄、加工，與mRNA特異結合，通過抑制翻譯或使mRNA降解而調節基因的表達。如果miRNA與其相應的靶mRNA以完全互補的方式結合在開放閱讀框，mRNA將發生特異性降解；如果miRNA以部分互補的方式結合在mRNA的3’端非翻譯區(3’UTR)，則僅僅抑制其翻譯，不影響mRNA的穩定性。miRNA的5’端有2～8個核苷酸區被稱為“種子區”，對miRNA與mRNA的3’UTR的配對非常重要［8］。miRNA“種子區”通常和相應的靶序列完全配對，因此可以用“種子區”序列預測miRNA的靶基因。在大多數情況下，miRNA“種子區”和相應靶序列的完全配對是其起調控作用的前提條件。一種miRNA可作用于多種mRNA靶點［9］，多個miRNA也可以作用于一個mRNA［10］。mRNA 的3’UTR可以包含多個miRNA的作用位點，并且與抑制翻譯的程度有關，miRNA結合的位點越多，抑制的程度就越大。由此形成復雜而又精確的網絡，調控著生物體的基因表達及生理功能，一旦miRNA的表達水平失衡，將可能導致疾病的發生。

2 miRNA與腫瘤的關系

腫瘤的發生是由于腫瘤細胞的無限增殖或凋亡失控引起的。正常的細胞已形成保護功能，以確保細胞的分裂、分化和凋亡過程協調有序地進行。雖然很多研究表明miRNA在腫瘤中表達異常，但對于它們的具體機制并未完全明了。目前大部分研究認為miRNA與腫瘤的發生有關是基于以下幾點：⑴在不同的腫瘤中，某些miRNA特異性的表達增多，顯示這些miRNA與基因突變一樣，可能為腫瘤的發生提供了某些有利因素［11-12］；⑵研究發現，miRNA直接調控腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡［13］；⑶許多miRNA直接表現為一種原癌基因或抑癌基因的作用［14-15］。因此，miRNA是一種新的生物分子，與腫瘤的發生、發展、轉移和預后存在著密切的聯系。

2.1 原癌基因作用

miRNA-155位于BIC基因第三個外顯子內，BIC基因是已知的癌基因之一。在人類B細胞淋巴瘤中，人們發現miRNA-155/BIC表達水平普遍增高，導致細胞異常增殖。還有研究發現，miRNA-155能直接下調myc基因的抑制因子(如MAD1、MXI1、ROX/MNT等)的表達，從而增強myc基因的活性，導致細胞發生癌變，形成B細胞淋巴瘤［16-17］。因此，miRNA-155可能作為一個原癌基因與myc基因具有協同作用。miRNA-10b位于HOXD基因家族，其表達水平在乳腺癌中明顯上調，其轉錄過程受轉錄因子Twist調控，該系列通過調控HOXD基因而提高轉移相關基因RHOC表達水平，促進腫瘤的增殖和轉移［18］。一項利用芯片的獨立研究檢測245個miRNA在正常組織和腫瘤組織中的表達差異，發現膠質母細胞瘤中miRNA-21表達升高，而在乳腺癌樣品中表達也有增加，因此認為miRNA-21可能在腫瘤發生中起到廣泛的作用［19］。也有應用反義核酸技術的研究發現，其通過抑制凋亡而并非促進細胞增殖來導致細胞的癌變［20-21］。另有研究發現，miRNA的異常可能會導致具有腫瘤特異性表型的表觀遺傳基因程序重組細胞的出現，而這些細胞日后將引起癌變［22］。

2.2 抑癌基因作用

某些miRNA表達的下調可能會引起腫瘤細胞侵襲力的增加，導致患者預后不佳，生存率下降。Takamizawa等［23］在2004年報道了第一個與肺癌相關的miRNA-let-7(let-7)，發現在非小細胞肺癌患者中let-7表達顯著降低。Johnson等［24］的研究發現，let-7高表達的肺癌患者生存率要顯著高于低表達患者，這可能是由于let-7過表達可負調控靶基因Ras的表達，抑制肺癌生長。Iorio等［19］對76例乳腺癌患者的腫瘤細胞進行miRNA表達分析發現，在乳腺癌患者中隨著miRNA-145的下調，腫瘤的增殖指數升高，miRNA-9-3在有高度血管侵襲和淋巴結轉移的乳腺癌患者中表達下調，提示miRNA-145和miRNA-9-3的正常表達可能有抑制腫瘤的作用。另一項關于乳腺癌和miRNA的研究發現，當乳腺癌具有轉移能力時，一些miRNAs的表達顯著缺失，而恢復這些miRNAs的表達則可抑制腫瘤細胞向肺部和骨骼的轉移［25］。miRNA-203在結直腸癌組織和細胞株中表達顯著降低，并可以抑制腫瘤細胞株的增殖，而且miRNA-203低表達的患者腫瘤數目更多和病理分期更高［26］。還有研究還發現，在慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)中， miRNA-15a和miRNA-16-1的表達下調將導致抗凋亡基因Bcl-2的明顯上調，并抑制腫瘤細胞的凋亡［27］，同時也可通過靶基因(cyclin D，CDK6)參與細胞周期的調控，抑制腫瘤細胞的增殖［28］，這些現象均提示某些miRNA具有抑癌基因的作用。

3 miRNA與膀胱癌的關系

目前，關于miRNA與膀胱癌的研究已經展開，并在不斷深入。幾個基于芯片技術和生物信息學的研究已發現一些與膀胱癌密切有關的miRNA。但這些miRNA到底是通過哪些具體的機制來促進或抑制膀胱癌的發生，目前還不是很清楚。

2009年有研究發現，miRNA的表達與膀胱癌的分期有關，在淺表性膀胱癌中高表達的有miRNA-10a，在肌層浸潤性膀胱癌中高表達的有miRNA-222和miRNA-125b，而在淋巴結陽性患者中高表達的有miRNA-452，認為miRNA-452能成為一種預測膀胱癌患者預后的指標［29］。最近Wiklund等［30］的研究發現，miRNA-200家族和miRNA-205在淺表性膀胱癌中表達要比在肌層浸潤性膀胱癌中高1.5～2.5倍，而且在浸潤性膀胱癌中miRNA-200家族和miRNA-205經常發生表達沉默，提示它們可能與腫瘤的進展有關，進一步研究發現miRNA-200c的表達與早期(Ta、T1期)膀胱癌的進展有關，能成為一種預測早期膀胱癌進展的生物學指標，并且可以指導早期膀胱癌治療方案的選擇。

Catto等［31］檢測了322個miRNA，發現有12個miRNA僅在膀胱癌組織中表達，其中有5～7個具有較高的診斷價值，靈敏度為90%～100%，特異度為80%～100%，miRNA-99a/100的表達下調可能預示著一個更好的結局，而miRNA-21/373表達升高的患者可能預后更差。Neely等［32］分析了膀胱癌細胞株中343個miRNA的表達水平，發現其中有9個miRNA(miR-21/miR-31/miR-200a/miR-200c/miR-205/miR-373/miR-487b/miR-498/miR-503)在淺表性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌中表達不同。進一步研究發現，相對于淺表性膀胱癌，浸潤性膀胱癌中miR-21表達升高，而miR-205表達下降，并且，在浸潤性膀胱癌中，miR-21：miR-205的比值要比淺表性膀胱癌高至少10倍以上，此比值能有效地區分淺表性和浸潤性膀胱癌，其靈敏度達100%，特異度為78%，能成為評價膀胱腫瘤浸潤性的潛在指標。

Chiyomaru等［33］通過寡核苷酸芯片技術分析顯示，轉染了miRNA-145/miRNA-133a的膀胱癌細胞株，大約有200個基因發生表達減少，而FSCN1(束蛋白1)基因是下調最明顯的。通過熒光素酶基因分析表明，膀胱癌細胞株轉染了miRNA-145/miRNA-133a后，FSCN1蛋白表達明顯減少，細胞的增殖、侵襲以及轉移顯著性受到抑制(P＜0.0001)。Dyrskj?t等［34］認為轉染了miRNA-129的膀胱癌細胞株，其細胞的生長明顯變的緩慢，進一步研究發現miRNA-129可能參與了細胞的凋亡過程，引起腫瘤細胞的自發凋亡。Ichimi等［35］發現，轉染了miRNA-30a-3p/miRNA133a/miRNA-199a的膀胱癌細胞株，其KRT7(角蛋白)的表達減少，進而抑制腫瘤細胞的生長。而Huang等［36］發現，miRNA-125b通過減少細胞周期中轉錄因子E2F3蛋白的表達，抑制E2F3-cyclinA2信號途徑，使膀胱腫瘤細胞生長在G期發生停滯。另一項研究發現miRNA-221在膀胱癌細胞中表達升高，如果使miRNA-221發生表達沉默，能通過TRAIL(腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體)途徑促使腫瘤細胞發生凋亡［37］。我們之前首次證實在膀胱癌組織中miRNA-203表達減低，而且在膀胱癌細胞株中，我們發現miRNA-203的高表達將抑制細胞的增殖，通過進一步研究，我們發現miRNA-203可能通過抑制Bcl-w基因的表達來發揮其抑癌基因的作用［38］。基因突變是公認的與腫瘤發生最相關的機制，van der Kwast等［39］認為在膀胱癌發生過程中，miRNA-7的表達下調和miRNA-10a的表達上調與FGFR3基因的突變機制有關，認為這些miRNA能成為優先于臨床和病理而早期診斷膀胱腫瘤的指標。

一直以來，所有泌尿科醫生都希望能利用尿液來早期發現膀胱腫瘤，但理想的尿液膀胱腫瘤標志物仍未被發現。目前，關于尿液中miRNA的研究也已開展。一項來自德國的研究發現，通過檢測尿液中miRNA-126：miRNA-152以及miRNA-182：miRNA-152的比值能將膀胱癌患者從正常人之中篩選出來，其中miRNA-126：miRNA-152的比值敏感度達72%，特異度達82%［40］。

4 展望

隨著對miRNA在膀胱癌中研究的深入，發現越來越多的miRNA與膀胱癌密切相關。miRNA通過表達上調或下調，與某些原癌基因、抑癌基因、凋亡相關基因相互作用，或調解某些細胞因子，參與腫瘤的生成、發展甚至侵襲轉移。但目前關于miRNA與膀胱癌的研究尚處于起步階段，如何精確預測miRNA及其靶mRNA，miRNA抑制靶基因蛋白翻譯的具體作用機制，以及哪些細胞因子參與了這些過程等等，都是等待我們去探索的未知區域。隨著最新的生物學實驗技術應用于miRNA的研究，人們對miRNA的表達調控網絡的認識將提高到一個新的水平。相信在不久的將來，以miRNA為靶點的診斷措施及生物靶向治療會應用于臨床中，為膀胱癌的治療提供一個更有效的手段。

［1］Jemal A, Siegel R, Xu J, et al.Cancer statistics, 2010［J］.CA Cancer J Clin, 2010, 60(5): 277-300.

［2］楊國良, 薄雋杰.尿液中膀胱腫瘤標志物檢測的研究進展［J］.中國癌癥雜志, 2009, 19(7): 557-561.

［3］Zhang B, Pan X, Cobb GP, et al.MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors［J］.Dev Biol, 2007, 302(1): 1-12.

［4］Bartel DP.MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism,and function［J］.Cell, 2004, 116(2): 281-297.

［5］Thomson JM, Newman M, Parker JS, et al.Extensive posttranscriptional regulation of microRNAs and its implications for cancer［J］.Genes Dev, 2006, 20(16): 2202-2207.

［6］Liu J, Carmell MA, Rivas FV, et al.Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi［J］.Science, 2004, 305(5689):1437-1441.

［7］Gregory RI, Shiekhattar R.MicroRNA biogenesis and cancer［J］.Cancer Res, 2005, 65(9): 3509-3512.

［8］Beezhold KJ, Castranova V, Chen F.Microprocessor of microRNAs: regulation and potential for therapeutic intervention［J］.Mol Cancer, 2010, 9: 134.

［9］Abrahante JE, Daul AL, Li M, et al.The caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl--1 controls developmental time and is regulated by microRNAs［J］.Dev Cell, 2003, 4(5): 625-637.

［10］Ambros V.The functions of animal microRNAs［J］.Nature,2004, 431(7006): 350-355.

［11］Volinia S, Calin GA, Liu CG, et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(7): 2257-2261.

［12］Lanza G, Ferracin M, Gafà R, et al.mRNA/microRNA gene expression profile in microsatellite unstable colorectal cancer［J］.Mol Cancer, 2007, 6: 54.

［13］Gaur A, Jewell DA, Liang Y, et al.Characterization of microRNA expression levels and their biological correlates in human cancer cell lines［J］.Cancer Res, 2007, 67(6):2456-2468.

［14］Slaby O, Svoboda M, Michalek J, et al.MicroRNAs in colorectal cancer: translation of molecular biology into clinical application［J］.Mol Cancer, 2009; 8: 102.

［15］Sayed D, Rane S, Lypowy J, et al.MicroRNA-21 targets Sprouty2 and promotes cellular outgrowths［J］.Mol Biol Cell, 2008, 19(8): 3272-3282.

［16］Metzler M, Wilda M, Busch K, et al.High expression of precursor microRNA-155/BIC RNA in children with Burkitt lymphoma［J］.Genes Chromosomes Cancer, 2004, 39(2):167-169.

［17］Eis PS, Tam W, Sun L, et al.Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas［J］.Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(10): 3627-3632.

［18］Ma L, Teruya-Feldstein J, Weinberg RA.Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer［J］.Nature, 2007, 449(7163): 682-688.

［19］Iorio MV, Ferracin M, Liu CG, et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer［J］.Cancer Res, 2005, 65(16): 7065-7070.

［20］Ciafrè SA, Galardi S, Mangiola A, et al.Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma［J］.Biochem Biophys Res Commun, 2005, 334(4): 1351-1358.

［21］Chan JA, Krichevsky AM, Kosik KS.MicroRNA-2l is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells［J］.Cancer Res, 2005, 65(14): 6029-6033.

［22］Kovalchuk O, Tryndyak VP, Montgomery B, et al.Estrogeninduced rat breast carcinogenesis is characterized by alterations in DNA methylation, histone modifications and aberrant micioRNA expression［J］.Cell Cycle, 2007, 6(16):2010-2018.

［23］Takamizawa J, Konishi H, Yanagisawa K, et al.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancer in association with shortened postoperative survival［J］.Cancer Res, 2004, 64(11): 3753-3756.

［24］Johnson SM, Grosshans H, Shingara J, et al.RAS is regulated by the let-7 microRNA family［J］.Cell, 2005, 120(5): 635-647.

［25］Tavazoie SF, Alarcón C, Oskarsson T, et al.Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis［J］.Nature, 2008, 45l(7175): 147-152.

［26］Chiang Y, Song Y, Wang Z, et al.Aberrant expression of miR-203 and its clinical significance in gastric and colorectal cancers［J］.J Gastrointest Surg, 2011, 15(1): 63-70.

［27］Cimmino A, Calin GA, Fabbri M, et al.microR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(39): 13944-13949.

［28］Linsley PS, Schelter J, Burchard J, et al.Transcripts targeted by the microRNA-16 family cooperatively regulate cell cycle progression［J］.MoI Cell Biol, 2007, 27(6): 2240-2252.

［29］Veerla S, Lindgren D, Kvist A, et al.MiRNA expression in urothelial carcinomas: important roles of miR-10a, miR-222, miR-125b, miR-7 and miR-452 for tumor stage and metastasis, and frequent homozygous losses of miR-31［J］.Int J Cancer, 2009, 124(9): 2236-2242.

［30］Wiklund ED, Bramsen JB, Hulf T, et al.Coordinated epigenetic repression of the miR-200 family and miR-205 in invasive bladder cancer［J］.Int J Cancer, 2011, 128(6):1327-1334.

［31］Catto JW, Miah S, Owen HC, et al.Distinct microRNA alterations characterize high- and low-grade bladder cancer［J］.Cancer Res, 2009, 69(21): 8472-8481.

［32］Neely LA, Rieger-Christ KM, Neto BS, et al.A microRNA expression ratio defining the invasive phenotype in bladder tumors［J］.Urol Oncol, 2010, 28(1): 39-48.

［33］Chiyomaru T, Enokida H, Tatarano S, et al.miR-145 and miR-133a function as tumour suppressors and directly regulate FSCN1 expression in bladder cancer［J］.Br J Cancer, 2010, 102(5): 883-891.

［34］Dyrskj?t L, Ostenfeld MS, Bramsen JB, et al.Genomic profiling of microRNAs in bladder cancer: miR-129 is associated with poor outcome and promotes cell death in vitro［J］.Cancer Res, 2009, 69(11): 4851-4860.

［35］Ichimi T, Enokida H, Okuno Y, et al.Identification of novel microRNA targets based on microRNA signatures in bladder cancer［J］.Int J Cancer, 2009, 125(2): 345-352.

［36］Huang L, Luo J, Cai Q, et al.MicroRNA-125b suppresses the development of bladder cancer by targeting E2F3［J］.Int J Cancer, 2011, 128(8): 1758-1769.

［37］Lu Q, Lu C, Zhou GP, et al.MicroRNA-221 silencing predisposed human bladder cancer cells to undergo apoptosis induced by TRAIL［J］.Urol Oncol, 2010, 28(6): 635-641.

［38］Bo J, Yang G, Huo K, et al.microRNA-203 suppresses bladder cancer development by repressing bcl-w expression［J］.FEBS J, 2011, 278(5): 786-792.

［39］van der Kwast TH, Bapat B.Predicting favourable prognosis of urothelial carcinoma: gene expression and genome profiling［J］.Curr Opin Urol, 2009, 19(5): 516-521.

［40］Hanke M, Hoefig K, Merz H, et al.A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer［J］.Urol Oncol, 2010, 28(6): 655-661.