生物芯片技術在肺癌研究中的應用價值

朱珉 于軍 周文利 付向寧

生物芯片技術是上世紀末生命科學領域取得的最大科學技術進展之一，是將各種生物信息分子如寡核苷酸、基因片段、cDNA片段或多肽、蛋白質等按預先設置的排列高密度固定在固相支持介質上行成微陣列，利用生物分子的特異性親和反應，如核酸雜交反應、抗原抗體反應等進行各種定性、定量分析的一種技術。其連續化、集成化、自動化，高通量的特點為后基因組時代基因功能研究、新藥研發及疾病早期診斷、轉歸、預后評估等提供了強有力的分析工具。自誕生以來，生物芯片技術發展迅猛，目前已經形成了全球年產值達近百億美元的銷售市場，具有明顯的高科技產業化前景。肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，目前已成為所有癌癥中遞增速度最快的惡性疾病[1]。近年來，盡管肺癌綜合治療技術有了很大進步，但肺癌長期生存率仍只有10%-15%[1]。主要原因是肺癌起病隱匿，現階段仍缺乏有效的篩查和早期診斷方法。目前已證實肺癌的發生發展是多基因共同參與、多途徑相互影響的復雜生物學進程，與多種癌基因、抑癌基因、DNA修復基因等變異或表達異常有關[2]。如何跳出過去僅僅局限于單基因的腫瘤分子學研究禁錮，從海量數據中尋找肺癌的發病因素和癌變多階段演進的分子機制，是目前科研和臨床工作者必須面對的問題。生物芯片技術的誕生克服了傳統檢測技術復雜、自動化程度低、檢測目的分子數量少、低通量等不足，為人們提供了一種全新的思維方式和微系統形式加速揭開癌癥的分子生物學奧秘[3]。本文將討論生物芯片技術在肺癌中的最新研究進展。

1 生物芯片分類及應用

生物芯片可分為基因芯片、蛋白芯片、細胞芯片和組織芯片等。世界上第一塊生物芯片即美國Affymatrix公司研制的基因芯片。該公司的研發人員于1992年運用半導體照相平板技術，對原位合成制備的DNA芯片作了首次報道。隨著化學染料、微電子技術、激光、數據分析技術的更新，目前基因芯片技術得到了迅猛的發展，其應用范圍也逐漸擴大。基于基因芯片的比較基因組雜交技術（comparative genome hybridization, CGH）在保留了CGH技術樣本量要求低、全基因組快速掃描等優點的同時，解決了其敏感性差、自動化程度低、操作復雜等技術問題，成為支持研究人員通過基因芯片技術準確研究與疾病有關的染色體變化的嶄新平臺。Bro?t等[4]運用該技術對85例Ib期肺腺癌組織進行了分析，結果發現56.5%的病例存在染色體5p的擴增，與此對應的是此區域端粒酶逆轉錄酶基因（telomerase reverse transcriptase,TERT）和泛素連接酶基因（S-phase kinase associated protein 2, SKP2）的大量擴增事件。此外，8q24（c-MYC）、11q13（CCND1）及14q13（TTF1）區域也發生了節段性擴增。這些變化與患者是否存在腫瘤復發和預后密切相關，作者認為分析肺癌染色體變化特征對于預測早期肺癌的預后大有幫助。國內雖然在基因芯片技術開發上起步較晚，但目前也具有地中海貧血、肺結核桿菌及其耐藥性、乙肝等疾病的檢測芯片專利。因為生物體的眾多功能最終都要通過蛋白質來實現，故在活性基因所表達的mRNA與蛋白質之間未能顯示出直接關系的前提下，基因芯片技術的應用必然會受到一定的限制，蛋白芯片技術也就隨之應運而生。蛋白芯片基本原理類似于酶聯免疫吸附試驗方法，即利用抗原抗體結合的特異性來檢測受檢標本內的抗原或抗體。通過報告分子如熒光標記的位置、熒光強弱等信號轉換成數據，即可以獲得有關的生物信息[5]。如多腫瘤標志物蛋白芯片檢測系統可以對多種腫瘤標志物進行聯合檢測，從而解決了在臨床診斷領域一直困擾人們的難題-如何快速而有效地早期發現腫瘤。表面增強激光解吸電離-飛行時間-質譜（surface enhanced laserdesorp-tion/ionizationtime of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS）技術，可使吸附在蛋白芯片上的靶蛋白離子化，在電場力的作用下計算出其質量電荷比，與蛋白質數據庫配合使用，可檢測到經典方法無法測定的低豐度蛋白質。Au等[6]利用該技術從21例無吸煙史的肺癌患者組織中篩選出與癌旁正常組織完全不同的新的痕量蛋白標記物，其進一步的純化和確定將為無吸煙史肺癌的診斷和靶向治療提供新的途徑。在目前提倡腫瘤個體化治療的背景下，蛋白芯片技術在新輔助化療敏感與耐藥差異蛋白篩查中也具有潛在的臨床應用價值[7]。細胞芯片和組織芯片技術是近年來基因芯片技術的發展和延伸。細胞芯片可以建立活體的多相反應體系，克服了基因、蛋白芯片僅僅檢測生物信息分子是否表達或表達量高低，而無法評估生命最基本單位-細胞整體功能的缺陷[8]。在新型藥物研發過程中，利用細胞芯片上的靶細胞篩選藥物，不僅可以提高藥物開發的效率，而且可以實現藥物篩選的敏感性、高通量和自動化集成。北京-生物芯片國家工程研究中心利用實時細胞阻抗傳感技術，實現了在細胞芯片上對細胞遷移過程的實時監測，為生物體胚胎發育、傷口愈合、腫瘤轉移等眾多生物過程提供了獨特而巧妙的檢測方法[9]。組織芯片則具有將分子生物學和組織形態學相結合的優勢，克服了傳統組織分析研究的瓶頸。結合免疫組織化學、原位雜交、原位PCR等技術，可以在基因、蛋白、細胞等不同水平進行形態與功能的研究[10,11]。Fernandes等[12]利用組織芯片技術在觀察到硫氧還蛋白家族蛋白在不同分化程度的肺癌組織中的差異表達后，闡明了硫氧還蛋白家族蛋白表達與肺癌腫瘤細胞增殖與分化之間的關系，從而為肺癌的發病機制提供了新的分子學基礎。陳洪雷等[13]以組織芯片為載體，利用量子點技術檢測Cav-1、CD147、MMP-2在人肺癌組織中的表達。不僅建立了有效的高通量蛋白表達分析系統，還證實Cav-1在肺癌侵襲轉移中的關鍵作用。

2 肺癌機制研究

腫瘤的形成都伴隨著DNA甲基化和組蛋白的修飾異常，其中異常甲基化包括基因組的低甲基化（hypomethylation）和抑癌基因啟動子CpG島高度甲基化（hypermethylation）。因檢測手段的效率低下，過去人們對DNA甲基化在癌癥致病中的認識十分有限。Rauch等[14]近期發明了一種基于MBD2b/MBD3L1蛋白復合物對甲基化CpG二核苷酸高親和力的甲基化高分辨率檢測方法——MIRA，在以微矩陣形式實現其高通量檢測后可以評估全基因組甲基化。研究者著重探討了HOX基因甲基化與肺癌發病之間的關系。通過對肺癌細胞系A549和正常人支氣管上皮NHBE細胞的大規模基因組掃描，將分別位于染色體2、7、12和17的HOXA、HOXB、HOXC和HOXD基因簇進行了甲基化分析。結果提示旁系同源基因HOXA6、HOXB6啟動子在A549細胞中發生高度甲基化，而在NHBE細胞中則無甲基化現象。在進一步的I期原發肺癌組織中的檢測表明，肺腺癌和肺鱗癌有不同的HOX基因甲基化譜，后者具有較少程度的HOX基因甲基化現象，但HOXA9與I期肺鱗癌的發病高度相關，具有較好的早期診斷價值。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）家族參與多種實體瘤的發生與發展，是抗腫瘤治療的重要靶點。在非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）中，EGFR突變與其磷酸化事件在NSCLC發病中的具體信號機制尚未闡明。VanMeter等[15]采用反向蛋白芯片（reverse phase protein microarray,RPPM）技術，結合激光捕獲顯微切割方法，觀察25例NSCLC患者腫瘤組織微環境中EGFR家族酪氨酸激酶結構域突變與其自身和下游信號分子的磷酸化事件。在所研究的6個磷酸化位點中，所有EGFR突變型患者腫瘤組織中的Tyr-1148、Tyr-1068磷酸化明顯增多，而Tyr-1045、HER2 Tyr-1248、IRS-1 Ser-612以及SMAD Ser-465/467磷酸化則顯著減少。研究者在體外EGFR突變型NSCLC細胞系的類比實驗中觀察到了相似的磷酸化事件，從而推測高突變率NSCLC細胞通過Tyr-1148、Tyr-1068磷酸化激活酪氨酸激酶活性，持續地觸發PI3K/AKT/mTOR等增殖信號。另一方面，高突變率NSCLC細胞還可同時通過減少Tyr-1045、IRS-1 Ser-612磷酸化及改變HER2異源二聚化途徑減少EGFR泛素化，使其失去對轉化抑制的能力，最終導致細胞癌變。

3 肺癌早期診斷

肺癌的早期診斷一直是人類夢寐以求的目標。年齡、吸煙史、職業暴露史、咳血、體重減輕、腫塊大小、肺活量測定等變量在預測早期肺癌上尚難以作出準確的判斷。Spira等[16]通過基因芯片在吸煙人群中對呼吸道上皮細胞基因表達差異進行分析，可以早期診斷潛在的罹患肺癌患者。研究者甄別出一個含80個基因簇的生物標志物集合，通過評分系統在吸煙者中判斷潛在肺癌和未患肺癌的準確性達到了83%，其特異性和敏感性分別為84%和80%。進一步的研究證實該生物標志物集合可以在早期預測I期肺癌的敏感性上達到90%，如能結合纖維支氣管鏡檢查進行細胞病理學分析，則可將肺癌早期診斷的敏感性進一步提高到95%。與臨床危險因素所組成的模型相比，該臨床基因組學模型對預測早期肺癌的敏感性有顯著性差異。特別在臨床醫師無法確定腫塊性質的患者當中，運用該基因組學模型對判斷是否罹患肺癌具有相當高的準確性[17]。Ye等[18]通過液相基因芯片技術從125例（37例小細胞肺癌，88例NSCLC）患者的組織中提取DNA進行研究，結果發現p53+EGFR二聯突變檢測對肺癌診斷的敏感性為50.4%；p53+p16+EGFR三聯突變檢測則可將敏感性提高到60%；當聯合檢測p53、p16、視網膜母細胞瘤Rb、EGFR基因的突變事件時，肺癌的診斷敏感性進一步提高到68%，且四聯基因突變檢測的特異性和準確性分別為90%和72.3%。Madoz-Gúrpide等[19]使用蛋白芯片技術從肺腺癌細胞系A549細胞的1,760個蛋白片段中篩選出肺癌的潛在蛋白標記物，然后通過質譜分析及利用肺癌患者血清與其產生的抗原抗體反應確定該類蛋白為PGP9.5，而正常健康人對照則無此反應，為肺癌的早期診斷提供了新的候選標志物。

4 肺癌靶向治療

由于藥物基因組學的飛速發展，傳統化療藥物的分子標志物不斷被發現，以其為指導的臨床試驗不斷取得令人驚喜的結果，推動著傳統化療進入個體化靶向治療的時代。目前，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）在肺癌靶向治療中的應用最為廣泛。在一項關于厄洛替尼治療NSCLC的多中心開放性臨床II期試驗[20]中，研究者從264例處于IIIb期/IV期的NSCLC患者腫瘤組織中提取核酸進行基因芯片分析，試圖尋找出接受厄洛替尼治療并從中獲益患者的基因表達譜特點。結果提示：臨床獲益患者的基因譜與無明顯效果的患者相比，EGFR、磷酸絲氨酸磷酸酶和Rap鳥苷酸交換因子5三種基因的表達顯著增高，且其表達與較長的無進展生存期呈正相關。Seike等[21]使用含389個探針的miRNA微陣列芯片對28例非吸煙肺腺癌患者病變組織和正常對照組織比較，結果發現有5種miRNA表達上調，其中miR-21變化最為顯著；13種miRNA表達下調，其中miR-486和miR-126*下降最為明顯。在進一步的研究中，作者分別探討了EGFR突變型和野生型肺腺癌細胞系H3255和 H441與miR-21表達的關系。證實EGFR無論突變與否，如能抑制miR-21表達，H3255和 H441均可發生凋亡，為肺腺癌的靶向治療提供了理論依據[20]。Stathmin蛋白家族由于其特有的微管解聚活性，在細胞的增殖和分化及腫瘤發生中有十分重要的作用。抑制Stathmin蛋白的表達已經成為腫瘤基因治療的新的靶點。Singer等[22]通過組織芯片TMA技術分析了117例NSCLC肺癌患者組織中Stathmin蛋白家族Stathmin及Sclip蛋白的表達水平。結果提示在鱗癌中Stathmin高度表達，而腺癌中兩者的表達水平均較正常肺組織顯著增高，尤其在組織受侵處異常明顯。作者隨后利用RNA干擾沉默其家族上游調控蛋白FBP-1的表達，發現不僅Stathmin及Sclip蛋白表達下調，且伴隨腫瘤細胞的遷移、侵蝕能力下降。此項研究為靶向治療肺癌提供了新的途徑。

5 肺癌預后

Landi等[23]使用miRNA微陣列芯片對165例腺癌和125例肺鱗癌患者進行miRNA表達分析，試圖發現miRNA表達與肺癌患者預后的關系。通過分層分析，發現肺腺癌中暫無明顯差異表達的miRNA，但miR-25、 miR-34c-5p、miR-191、let-7e、miR-34a五種miRNA的表達對肺鱗癌的生存期具有較高的預測價值。在107例男性早期鱗癌患者中，基于交叉驗證監督原則所具有高死亡率風險的62例患者中最終有36例死亡（58.0%），而具有低死亡率風險的45例患者中最終僅有12例死亡（26.7%）。Chen等[24]使用DNA芯片技術分析了185例NSCLC患者的病理標本，從672個具有侵襲特點基因中篩查16個與生存有關的基因，發現DUSP6、MMD、STAT1、ERBB3和LCK為5個高危基因，是患者無復發生存時間的獨立預后因子。Yoshizawa等[25]利用組織芯片技術分析了300例NSCLC患者AKT信號途徑中相關蛋白磷酸化事件與其預后的關系。結果提示eIF4E、AKT、TSC2、mTOR、S6和Erk1/2蛋白分別有39.9%、78.8%、5.1%、46.7%、27.1%和16.6%發生磷酸化，且eIF4E、AKT磷酸化事件無論是獨立還是聯合評估均預示較短的生存期。在聚類分析中AKT、mTOR、eIF4E、S6磷酸化陽性患者的生存期最短，而無AKT、Erk1/2磷酸化的NSCLC患者有較好的預后，其5年生存率達到了75%，平均生存中位數為9.4年。在多變量分析中，eIF4E磷酸化為判斷NSCLC患者生存期的獨立危險因子。

6 展望

目前，生物芯片在國內外已形成研究與開發的熱潮。因其技術尚無標準化平臺，各家公司的芯片技術都各具特色，數據采集出口無法統一，由此帶來結果評估上的混亂。但另一方面，基于生物個體遺傳信息多樣性的特點，生物芯片個體化發展亦成為其研發趨勢。作為一項可能成為實驗室研究或臨床普遍采用的潛在技術，生物芯片在樣品制備和標記、增加信號檢測靈敏度、功能模塊高度集成化等方面仍有較大空間改進。相信這項新一代生物技術能為肺癌診斷、新藥開發、個體化治療及預后評估等方面帶來革命性的變化。