非小細胞肺癌吉西他濱藥物耐藥相關基因研究進展

陳瑩 錢曉萍 劉寶瑞

吉西他濱是目前非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）常用的化療藥物之一，其在NSCLC的一線治療中已取得較好的療效。然而由于不同個體間腫瘤細胞的生物學特性差異較大，對化療藥物的敏感性差異亦大，使其在單藥治療初治或既往化療失敗患者的總有效率僅為20%左右[1]。隨著藥物基因組學、藥物遺傳學的發展，基因指導下個體化治療成為提高NSCLC化療療效的有效途徑之一，確定藥物的相關預測性分子標志物從而指導臨床治療、提高療效被廣泛關注。現就近年來吉西他濱藥物耐藥相關基因在NSCLC個體化治療方面的研究進展作一綜述。

吉西他濱是嘧啶類抗代謝藥物，屬于細胞周期特異性藥物，主要作用于DNA合成期，在一定條件下也可以阻止細胞從合成前期向合成期進展。吉西他濱進入腫瘤細胞內被轉化為具有活性的吉西他濱磷酸鹽，影響DNA合成和修復，從而抑制腫瘤細胞分裂，誘導腫瘤細胞凋亡。腫瘤細胞對吉西他濱的藥物抵抗主要涉及藥物轉運、藥物代謝、藥物作用靶點這三個方面。

1 藥物轉運相關基因

1.1 平衡型核苷轉運載體1（human equilibrative nucleoside transporter1, hENT1） 吉西他濱為親水性物質，不能通過自由擴散方式進入細胞內，而需要相應的載體如hENT1、hENT2、聚集型核苷轉運載體（human concentrate nucleoside transporter）1、2、3（hCNT1、hCNT2、hCNT3）轉運入細胞內，其中起主要作用的是hENT1，缺乏hENT1的細胞對核苷類似物有高度抵抗作用[2]。日本名古屋大學醫學研究所Achiwa等[3]通過RT-PCR方法檢測了22種NSCLC細胞株的hENT1 mRNA表達水平，來研究其與吉西他濱敏感性的關系，結果顯示hENT1 mRNA表達水平與吉西他濱半數抑制濃度（50% inhibiting concentration, IC50）呈負相關（r=-0.676,9,P=0.000,5)，因此得出結論hENT1 mRNA上調可以增加吉西他濱藥物對NSCLC細胞株敏感性，hENT1可以作為吉西他濱治療NSCLC的預測分子。該研究小組同時通過Western blot方法檢測了14種NSCLC細胞的hENT1蛋白表達，并研究其與hENT1基因表達以及吉西他濱藥物敏感性的關系[4]，結果顯示hENT1蛋白表達與其基因表達明顯相關（r=0.533, P＜0.05)，并且其蛋白表達與吉西他濱藥物IC50呈負相關（r=-0.622, P＜0.05），并采用免疫組化方法檢測了接受吉西他濱化療的24例NSCLC患者石蠟組織切片的hENT1蛋白表達，結果顯示hENT1蛋白表達陽性患者在含吉西他濱治療中明顯獲益（P＜0.05），與體外研究結果一致。意大利Toffalorio1等[5]用siRNA方法下調了兩株肺癌細胞株A549、H1703的hENT1 mRNA表達水平后發現，吉西他濱IC50值明顯提高（P=0.018），可以得出與上同樣的結論。而國內關于hENT1在NSCLC吉西他濱藥物敏感性方面的研究則罕見報道。在hENT1的基因多態性方面，美國賓西法尼亞洲的彼茲堡大學Myers等[6]研究發現攜帶hENT1 CGG/CGC基因型者hENT1 mRNA表達水平較高（P=0.12），由此可以推論hENT1的基因多態性可能通過影響hENT1 mRNA表達水平從而影響吉西他濱藥物敏感性。

1.2 ATP結合小盒（ATP-binding cassette, ABC）轉運載體 ABC轉運載體可以將細胞內的藥物泵出細胞外，與核苷轉運載體共同維持細胞內藥物濃度的平衡。這類基因或者表達的蛋白參與多藥耐藥（multidrug resistance,MDR），主要包括p-葡萄糖蛋白（p-glyco-protein, p-gp）和MRP5（ABCC5）。荷蘭VU大學醫學中心Bergman等[7]研究了人體包括NSCLC在內的五種不同腫瘤細胞株及其p-gp、MRP1（ABCC1）過表達的變異細胞株與吉西他濱藥物敏感性關系以及多藥耐藥細胞對吉西他濱敏感性的機制，結果顯示，NSCLC的4種變異細胞與對照組相比均對吉西他濱敏感（P＜0.01），表明p-gp、MRP1過表達細胞對吉西他濱更加敏感，其可能機制為：多藥耐藥引起的脫氧胞苷激酶（deoxicytidine kinase, dck）表達增高進一步增加了細胞內的吉西他濱三磷酸鹽（dFdCTP）積累，并且促進吉西他濱結合到腫瘤細胞DNA鏈從而終止其延長，使得其對吉西他濱更加敏感。因此，多藥耐藥的腫瘤復發患者，可以選擇檢測p-gp、MRP1表達水平作為吉西他濱臨床治療的預測指標。日本Oguri等[8]通過RT-PCR方法檢測了17種NSCLC細胞株的ABCC5 mRNA表達水平，分析其與吉西他濱敏感性的關系，結果顯示ABCC5 mRNA表達水平與吉西他濱敏感性呈負相關（P＜0.01），并且使用ABCC5抑制劑扎普斯特分別作用于兩種NSCLC細胞株后，其對吉西他濱藥物敏感性明顯增加；同時采用siRNA方法作用于細胞株，細胞株ABCC5 mRNA的表達水平明顯降低，吉西他濱藥物敏感性明顯增加。但是目前關于ABC轉運載體相關基因仍主要集中于體外研究，此類基因是否可以作為NSCLC吉西他濱藥物敏感性預測相關基因尚需要大量大樣本臨床回顧性及多中心前瞻性臨床研究。

2 藥物代謝相關基因

2.1 脫氧胞苷激酶（deoxicytidine kinase, dck） 吉西他濱進入細胞后，首先在細胞內通過脫氧胞苷激酶的作用被磷酸化為單磷酸鹽形式，這是進一步將吉西他濱轉變為有活性的三磷酸核苷的限速步驟，同時對于吉西他濱的活性尤為重要。Dck作為吉西他濱轉化為活性形式的限速酶，其表達水平與吉西他濱藥物敏感性有著一定的關系。

荷蘭VU大學醫學中心Kroep等[9]研究了包括肺癌在內的8種不同起源的小鼠移植瘤組織的dck表達與吉西他濱敏感性關系，結果顯示dck活性以及其蛋白表達水平與吉西他濱敏感性呈正相關（P＜0.001），同時dck mRNA表達水平與dck活性以及蛋白表達水平明顯相關，但是并未發現dck mRNA表達水平與吉西他濱敏感性相關，可能與樣本含量太小有關，尚需要進一步研究dck mRNA表達水平與吉西他濱敏感性的關系。日本名古屋大學Achiwa等[3]指出dck mRNA表達水平下調與NSCLC吉西他濱獲得性耐藥有關，但是在22種NSCLC細胞株中未發現dck mRNA表達水平與吉西他濱敏感性明顯相關。法國一項小樣本臨床回顧性研究[10]采用免疫組化方法研究了43例均接受含吉西他濱方案化療的NSCLC患者的腫瘤組織的dck蛋白表達水平與患者臨床預后的關系，其中28例dck蛋白表達陽性，但是未發現其表達水平與臨床預后有明顯相關性。

2.2 cN-II 5’-NT（nucleotidase） cN-II 5’-NT為細胞內重要的核苷酸去磷酸化酶，吉西他濱的磷酸化代謝產物可能被該酶降解，因此其表達水平可能與吉西他濱藥物敏感性有一定關系。法國Seve等[10]同時還研究了43例接受含吉西他濱化療的NSCLC患者cN-II蛋白表達水平與臨床預后的關系，結果顯示cN-II蛋白低表達者（陽性染色細胞＜40%）的總生存期明顯比高表達者短，分別為6個月、11個月（P=0.047）；同時對年齡、性別、組織類型、分期、體重以及免疫組化結果進行COX多因素變量分析，結果顯示，cN-II表達水平可以作為總生存期的獨立預后因素（P=0.02）。

2.3 胞苷脫氨酶（cytidine deaminase, CDA） 吉西他濱也可以被CDA脫氨基引起其失活，Eliopoulos以及Neff等[11,12]研究認為轉染細胞中的CDA過表達降低了吉西他濱的敏感性。并且有研究[13]表明，許多CDA啟動子區域的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP）可能影響其表達以及活性。意大利Tibaldi等[14]報道，在接受順鉑/吉西他濱方案化療的進展期NSCLC高加索人種患者中，CDA第27位密碼子基因多態性與其療效明顯相關。攜帶CDA27 Lys/Lys的患者中位疾病進展時間（8.4個月）及中位總生存期（13.6個月）比攜帶CDA27 Lys/Gln（5.0個月、13.6個月）以及CDA27 Gln/Gln（3.3個月、4.1個月）基因型患者明顯延長（P=0.006, P=0.002）；與攜帶Lys/Gln、Gln/Gln基因型患者相比，攜帶Lys/Lys的患者臨床獲益率明顯提（92.6% vs 75.9%, 55.6%; P=0.04），同時3級及以上中性粒細胞、血小板減少毒副作用增加，其機制可能與攜帶CDA27 Lys/Lys基因型患者CDA活性較低有關。新加坡國立大學Soo等[15]的研究表明，CDA基因第435位密碼子的多態性與臨床也明顯相關。在接受含吉西他濱方案化療的53例晚期NSCLC亞裔患者中，攜帶CDA453 C/C基因型患者的中位疾病進展時間明顯長于攜帶CDA453 C/T及T/T基因型的患者（6.3個月 vs 3.3個月，P=0.018），且客觀緩解率明顯提高（62% vs 29%,P=0.017）。

3 藥物作用靶點相關基因

3.1 核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase, RR） RR是DNA合成通路中的限速酶，它能使核苷酸轉化為脫氧核苷酸，后者是DNA合成和修復中必不可少的原料。RR包括2個亞單位：核糖核苷酸還原酶亞基1（ribonucleotide reductase subunit1, RRM1）和RRM2。RRM1是核苷酸結合位點，控制底物的特異性和整個酶的活性，同時也是核苷類似物系的化療藥物的結合位點；RRM2是一個金屬結合位點，有攜帶接觸抑制區，控制底物轉化的功能[16]。吉西他濱二磷酸鹽可抑制RR，減少DNA合成和修復所需的脫氧核苷酸量，尤其是三磷酸脫氧核苷，使DNA合成障礙。Davidson等[17]研究認為RRM1可能是吉西他濱抗腫瘤作用的主要靶點。

Davidson等[17]選擇NSCLC細胞株H358和H460進行的一項體外實驗發現，吉西他濱耐藥細胞株中的RRM1 mRNA表達水平以及蛋白表達水平明顯高于對照組（吉西他濱敏感組），因此認為RRM1表達水平和吉西他濱敏感性有關。H. Lee Moffitt癌癥研究中心Bepler等[18]選擇H23細胞株進行體外研究了RRM1 mRNA表達水平與吉西他濱IC50關系，H23-R1（吉西他濱耐藥株）RRM1 mRNA表達水平比對照組高2.5倍-3.5倍，其吉西他濱IC50值比對照組高8倍，而H23siR1（吉西他濱敏感株）RRM1 mRNA表達水平比對照組低5倍，其吉西他濱IC50值比對照組低10倍，因此，可以認為RRM1 mRNA高表達可導致吉西他濱耐藥，而低表達增加吉西他濱的敏感性。

一項來自H. Lee Moffitt癌癥研究中心的大樣本臨床回顧性研究[19]顯示，187例僅接受手術切除的I期NSCLC患者中，腫瘤組織RRM1 mRNA高表達者總生存期（＞120個月 vs 60.2個月，P=0.02）、無疾病生存期（120個月 vs 60.2個月，P=0.004）均明顯長于低表達者，因此RRM1 mRNA表達水平是生存預后指標。而國內外多項臨床回顧性研究發現，在晚期接受化療的NSCLC患者RRM1 mRNA低表達提示預后較好。西班牙肺癌協作組織Rosell等[20]采用RT-PCR方法對100例晚期NSCLC患者的石蠟組織進行檢測，發現21例接受吉西他濱/順鉑治療患者中RRM1 mRNA低表達組較高表達組的中位生存期、無疾病進展期均明顯延長（13.7個月 vs 3.6個月，P=0.009；8.4個月 vs 2.7個月，P=0.020）；該小組織成員[21]又對67例IIb期、IIIa期和IIIb期術后接受含吉西他濱方案化療的NSCLC患者腫瘤組織進行檢測，進一步證實了RRM1 mRNA低表達組較高表達組的死亡風險降低了70%，中位生存期明顯延長（52個月 vs 26個月，P=0.018），并且RRM1 mRNA低表達組具有更好的腫瘤緩解率、完全切除率和病理完全緩解率。Ceppi等[22]對70例晚期NSCLC患者進行的回顧性研究，也證實RRM1 mRNA低表達組中位生存期明顯延長（13.9個月 vs 10.9個月，P=0.039）。中南大學湘雅醫院梁偉軍等[23]采用免疫組化方法研究了RRM1蛋白表達水平與NSCLC術后吉西他濱聯合順鉑輔助化療預后的關系，發現RRM1蛋白低表達組中化療組和未化療組中位生存期分別為42個月和22個月（P=0.010），RRM1高表達組中化療組和未化療組中位生存期分別為28個月和21個月（P=0.092），可以看出RRM1蛋白低表達的NSCLC患者更能從術后含吉西他濱順鉑方案化療中獲益，與國外研究結果一致。

H. Lee Moffitt癌癥研究中心Bepler等[18]在對35例局部進展期NSCLC患者設計的一項前瞻性的II期臨床試驗中，采用RT-PCR技術檢測RRM1 mRNA表達水平，發現完成了2個周期吉西他濱/順鉑方案化療患者的RRM1 mRNA表達水平與臨床療效呈負相關（r=-0.498,P=0.002），因此認為接受吉西他濱/順鉑方案化療患者其腫瘤組織RRM1 mRNA低表達者更能獲益。該中心2009年進一步完成的III期臨床試驗[24]也同樣證實了上述結論。

RRM1多個位點的單核苷酸多態性與接受吉西他濱化療的NSCLC患者預后亦有一定的關系。有研究[25]表明，RRM1第2,464位密碼子多態性與吉西他濱敏感性有關，在62種腫瘤細胞中與攜帶野生型RRM12464G/G相比，攜帶RRM12464G/A基因型細胞對吉西他濱更加敏感（P=0.011）。Bepler等[26]對286例術后白種及非洲美裔人群NSCLC患者RR第37位及第524位密碼子聯合分析，結果顯示攜帶RR37CC-RR524TT基因型患者總生存期及無疾病生存期更長。但廣東肺癌協會一項亞裔人種RRM1基因多態性研究[27]提示攜帶RRM1C(-)37A患者無進展生存期較攜帶A/A、C/C基因型患者明顯延長（30.7周 vs 24.7周 vs 23.3周，P=0.043），攜帶RRM1C(-)37A患者更能從含吉西他濱化療中獲益。而北京軍事醫學科學院附屬醫院林莉等報道[28]，110例肺癌患者血標本中RRM1(-)37位點的基因型與肺癌患者的一般狀態，療效及生存時間均無相關性。

3.2 DNA修復相關基因 眾所周知，DNA修復能力是影響鉑類藥物療效的重要原因，而鉑類藥物聯合吉西他濱是臨床上NSCLC最常用的化療方案之一，同時由于吉西他濱的主要作用機制是影響DNA的合成和修復，因此DNA修復能力亦可能是影響吉西他濱藥物抵抗的重要原因之一。DNA切除修復主要有堿基切除修復（base-excision repair, BER）、DNA雙鏈斷裂修復（DNA double-strandbreak repair, DDSBR）、錯配修復（mismatch repair, MMR）及核苷酸切除修復（nucleotide- excision repair, NER）4種途徑[29]。

3.2.1 切除修復交叉互補基因1（excision repair crosscomplementary 1, ERCC1） ERCC1是NER中的重要基因，在DNA修復途徑中起了關鍵性作用，而吉西他濱主要作用靶點之一RRM1，可以提供脫氧核苷酸，用于填補由于ERCC1切除所產生的空隙，從而參與DNA鏈修復[30]。許多臨床研究[20,24]表明，ERCC1 mRNA或蛋白表達水平與接受含吉西他濱方案化療的NSCLC患者的預后有關。Rosell等[20]采用RT-PCR方法對100例晚期NSCLC患者的石蠟組織進行聯合基因檢測，結果表明ERCC1 mRNA與RRM1 mRNA表達水平明顯相關（r=0.410, P＜0.001)，在21例接受吉西他濱/順鉑治療的患者中，ERCC1 mRNA與RRM1 mRNA均低表達者較兩者均高表達患者中位生存期明顯延長（P=0.016）。H. Lee Moffitt癌癥研究中心2009年完成的一項前瞻性III期臨床試驗[24]也得出相同的結論：170例NSCLC患者接受吉西他濱單藥或卡鉑/吉西他濱治療后，原位RRM1、ERCC1蛋白表達水平與疾病緩解呈明顯負相關（r=-0.41, P=0.001; r=-0.39, P=0.003）。有體外研究[31]顯示：ERCCI基因第118位密碼子的基因多態性與其mRNA及蛋白表達水平相關。韓國Ryu等[32]對亞裔人群進行的研究證實了接受吉西他濱/順鉑方案化療的進展期NSCLC患者攜帶ERCC1 codon118 C/C基因型總生存期明顯較C/T及T/T基因型患者延長（P=0.005,8）；但是Tibaldi、Zhou等[14,33]通過對中晚期NSCLC患者進行研究，提出一個相反的結果，即ERCC1 codon118 C/C基因型生存期較C/T、T/T型明顯減少，但未達到統計學差異（P=0.41, P=0.37）。

3.2.2 著色性干皮病基因D（xeroderma pigmentosum pomplementary group D, XPD） XPD又稱作ERCC2，在NER系統中作為進化保守的DNA解旋酶，發揮5’→3’解旋酶活性，參與兩種NER途徑和基因轉錄[34]。XPD的基因多態性可以改變DNA修復能力。Rosell等[35]研究表明，XPD基因第751位密碼子SNP與化療效果的關系與化療藥物的聯合使用有關，在接受吉西他濱+順鉑治療的進展期NSCLC患者中，具有A/C基因型患者的疾病進展時間明顯長于具有A/A基因型的患者（9.6個月 vs 4.2個月，P=0.03）。

3.2.3 X線修復交叉互補基因3（X-ray cross-complementing group3, XRCC3） XRCC3是參與DNA的同源重組修復途徑從而保持染色體的穩定性和修復DNA損傷重要基因之一。XRCC3編碼的蛋白在同源重組修復過程中起著重要作用，其第7外顯子C→T變異，導致241位密碼子Thr→Met，該密碼子的多態性和吉西他濱的敏感性有一定關系。西班牙肺癌協作組[36]采用探針法檢測135例接受吉西他濱/順鉑化療的IIIb或IV期肺癌患者外周血中XRCC3基因的多態性進行分析，發現XRCC3第241密碼子基因型與患者的生存期明顯相關，Met/Met型患者中位生存時間為16個月，Thr/Thr型為14個月，Thr/Met型僅為10個月（P=0.01）。

3.2.4 乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1） BRCA1通過參與細胞內DNA修復、細胞周期調節、mRNA轉錄調控及蛋白捕獲等途徑而對DNA損害應答[37]，同時還被證實有調節有絲分裂的作用，與具有紡錘體毒性的藥物（紫杉類、長春堿類）敏感性有關[38]。Taron等[39]研究小組報道，對55例手術切除并接受吉西他濱/順鉑新輔助化療的IIb期-IIIb期的NSCLC標本檢測BRCA1 mRNA 表達水平，結果BRCA1 mRNA高表達的患者中位生存期為12.7個月，中表達的28例患者中位生存期為37.8個月，低表達的15例患者尚未達到中位生存時間；而Boukovinas等[40]報道，對102例接受吉西他濱/多西他賽一線治療的進展期NSCLC患者的石蠟組織進行BRCA1、RRM1、RRM2聯合基因檢測，發現BRCA1 mRNA與RRM1 mRNA表達水平正相關（r=0.27, P=0.008），與RRM2 mRNA表達水平呈負相關（r=-0.25, P=0.02），且隨著BRCA1 mRNA表達水平增高，其臨床療效增加［優勢比（odds ratio, OR）=1.09，P=0.01］，疾病進展風險下降［危害比（hazard ratio, HR）=0.99，P=0.36］；而隨著RRM1 mRNA和RRM2 mRNA表達水平增高，臨床療效（RRM1: OR=0.97, P=0.82; RRM2: OR=0.94, P=0.000,1)下降，疾病進展風險（RRM1: HR=1.02, P=0.001; RRM2:HR=1.005, P=0.01）增高。同時對RRM1 mRNA和BRCA1 mRNA表達水平聯合分析顯示，低危、中危、高危三組疾病進展時間（times to progression, TTP）分別為10.13個月、4.17個月、2.30個月（P=0.001）。因此，我們可以推論：BRCA1 mRNA低表達的NSCLC患者可以從吉西他濱/順鉑聯合方案化療中獲益，而高表達者則可以從多西他賽聯合吉西他濱化療中獲益。

3.2.5 ATM/chek2及ATR/chk1信號轉導通路相關基因ATM和ATR屬于磷脂酰肌醇-3-激酶樣激酶家族，是DNA損傷檢查點的主要成員。它們被不同類型的DNA損傷所激活，通過磷酸化相應的下游蛋白Chk1和Chk2等，調節細胞周期各個檢查點，引起細胞周期阻滯，使DNA損傷得以修復。多項體外研究[41,42]顯示：吉西他濱引起的細胞DNA復制受損可以激活這兩條信號傳導通路，而這兩條信號轉導通路相關蛋白如ATM、chk1、ATR等表達缺失可以增加吉西他濱對包括NSCLC在內的多種腫瘤細胞的藥物敏感性，但是尚缺乏大量回顧性及前瞻性臨床試驗的驗證。

因此，ERCC1、XPD、XRCC3、BRCA1等DNA修復相關基因可以作為NSCLC患者以吉西他濱為基礎的個體化治療的潛在臨床預測指標，但是仍需要大量的多中心大樣本臨床前瞻性研究。而ATM/Chek2及ATR/Chk1信號轉導通路相關基因與吉西他濱敏感性的相關性只在一些體外實驗中得以證實，尚缺乏臨床試驗的驗證。

3.3 細胞凋亡相關基因 吉西他濱部分通過誘導細胞凋亡而發揮其細胞毒作用，因此與細胞凋亡相關的信號轉導通路的相關基因或蛋白的表達可能與吉西他濱藥物抵抗相關。p53是一原癌基因，在細胞凋亡、基因組的穩定性、細胞衰老以及分化、生長停滯方面起重要作用，該基因的突變常導致其功能缺失，是人類腫瘤最常見的一種基因改變。但是由于p53基因檢測方法的多樣性以及其特殊的方法步驟、評價標準，使得其是否突變的狀態與包括吉西他濱等抗腫瘤藥物敏感性及臨床預后的關系上尚存在很大爭議。一項體外研究認為[43]，吉西他濱是通過依賴Bcl-2的激活半胱天冬酶9的途徑誘導NSCLC細胞凋亡的，與p53是否突變無明顯相關性，其主要是通過激活胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）、下調bcl-2以及AKT失活而引起細胞凋亡。而一項基于4,571例NSCLC患者的回顧性研究[44]卻發現：用免疫組化方法檢測腫瘤組織的p53蛋白表達情況，其中p53蛋白表達陽性者對吉西他濱更耐藥（P=0.010,8）。另外，韓國首爾大學Lee等[45]報道：通過測序法檢測57例接受吉西他濱作為一線或二線化療的NSCLC患者的EGFR、K-ras突變狀態及用免疫組化方法檢測患者石蠟包埋腫瘤組織的p-Erk、p-Akt蛋白表達水平，結果顯示：EGFR、K-ras狀態以及p-Akt蛋白表達水平與患者的疾病進展時間、疾病客觀緩解率均無明顯相關性，而p-Erk(+)患者客觀緩解率明顯高于陰性患者（30.6% vs 0%, P=0.01）。

PNAS-4是在大規模測序中確定的一個新的基因，它的過表達可以增加細胞凋亡[46]。Hou[47]等研究發現，在A459肺癌細胞株體外藥敏試驗中，PNAS-4高表達組細胞活性比對照組低18%；吉西他濱處理后，PNAS-4高表達組與對照組相比，細胞活性明顯降低（36% vs 70%）；流式細胞儀測定細胞凋亡實驗顯示，PNAS-4高表達/吉西他濱組凋亡比例明顯比單獨吉西他濱處理組高（61.4% vs 28.6%）；且體內研究表明PNAS-4可以抑制A459小鼠移植瘤的生長，與PNAS-4、吉西他濱單獨使用相比，兩者聯合應用可以增加腫瘤組織內細胞凋亡，但是并不引起更大的毒副作用，因此，PNAS-4可以抑制腫瘤生長并且通過凋亡作用增加吉西他濱的敏感性。PNAS-4基因有可能作為治療肺癌的潛力候選者。

4 小結及展望

吉西他濱是目前NSCLC常用化療藥物之一，其藥物抵抗是個復雜的過程，有多種基因參與，通過對患者相關基因或蛋白表達水平以及基因遺傳多態性的分析，可以指導臨床選擇最佳治療方案，從而提高藥物治療的有效率，避免嚴重毒副反應發生，延長患者的生存期，提高生活質量，真正實現個體化治療。

吉西他濱首先通過hENT1等藥物轉運相關載體至細胞內，通過抑制RR及DNA合成從而發揮其抗腫瘤作用。dck是吉西他濱轉化為其活性形式從而發揮其抗腫瘤作用的限速酶，而5’-NT、CDA則是主要的導致其失活的酶。從上述關于NSCLC吉西他濱藥物耐藥相關基因研究的文章中可以看出：（1）藥物轉運相關基因：hENT1 mRNA高表達或蛋白表達陽性提示吉西他濱敏感，可獲得更好的生存優勢，但目前在NSCLC方面，國外研究主要對象集中于體外細胞株，臨床回顧性研究較少，且尚未出現前瞻性研究，國內關于hENT1則罕見報道；（2）藥物代謝相關基因：體外研究顯示dck活性以及蛋白表達水平與吉西他濱敏感性呈正相關，但是并未發現dck mRNA表達水平與吉西他濱敏感性明顯相關，在極少的臨床回顧性研究中并未發現陽性結果；關于CDA的研究主要集中于單核苷酸多態性與臨床預后的關系研究，攜帶CDA27Lys/Lys、CDA453C/C基因型患者更能從含吉西他濱化療方案中獲益，獲得生存優勢；而在含吉西他濱化療的NSCLC患者中，cN-II蛋白低表達者的總生存期明顯比高表達者短；（3）藥物作用靶點相關基因：關于RRM1 mRNA表達水平以及其基因多態性與吉西他濱藥物敏感性和接受吉西他濱化療的NSCLC患者臨床預后關系，國內外報道很多。從大量體外研究及臨床研究中可以發現，RRM1 mRNA表達水平可以作為吉西他濱敏感性及其臨床療效預測的重要分子標志。在中晚期接受化療的NSCLC患者中RRM1 mRNA高表達提示預后較差，而早期僅接受手術治療患者RRM1高表達者預后較好。同時，由于種族差異性，RRM1的多個位點的單核苷酸多態性與RRM1 mRNA表達水平間尚沒有發現有一定的聯系，且相同位點多核苷酸多態性與臨床預后的關系并不一致；由于吉西他濱主要通過影響DNA合成和修復，從而抑制腫瘤細胞分裂，誘導腫瘤細胞凋亡發揮細胞毒作用，因此DNA修復相關基因，如ERCC1、BRCA1、XRCC3、XPD等基因表達水平或其單核苷酸多態性亦與接受含吉西他濱方案化療的NSCLC患者預后有一定的相關性，但由于種族差異，各臨床研究得出的結論不盡相同；而細胞凋亡相關基因與吉西他濱藥物敏感性相關關系方面仍存在很大爭議，需要進一步的研究加以證實。

目前在國內外開展的關于NSCLC吉西他濱藥物敏感性基因的體內外研究中，部分基因研究結果并不一致，選擇合適的分子預后指標還需要大量的大樣本臨床回顧性及多中心臨床前瞻性研究；在基因分子選擇上多限于單個基因的表達譜或多態性研究，聯合基因檢測報道并不多，顯然，多基因的全面分析可能更具有臨床應用潛力；相關基因表達水平的檢測標本主要是手術切除或者支氣管鏡活檢獲得的腫瘤組織，相對難以獲取，如何通過其他臨床易得樣本如外周血標本等進行基因檢測，也是一個尚待解決的問題。同時，我們還需要進一步進行分子機制等基礎研究以尋找到更多的與吉西他濱藥物耐藥相關的基因，從而進一步指導藥物的臨床應用。