中藥血清藥理方法學的研究概況

柯 瑋 朱建華

（皖南醫(yī)學院醫(yī)學三系，安徽 蕪湖 241002）

由于中藥粗制劑中含有大量雜質(zhì)，另外，中藥作用人體后發(fā)揮作用的具體成分不詳，若直接加入體外反應(yīng)系統(tǒng)，其pH、鞣質(zhì)、無機鹽等許多非特異性理化因素，都會干擾實驗，產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果；另外，中藥口服后其有機成分在胃腸內(nèi)會受到消化液和腸道菌微生態(tài)轉(zhuǎn)化，特別是苷類化合物，其糖基使之不易從腸道吸收，腸道菌使苷分解，釋放的苷元易被腸道吸收而成為真正產(chǎn)生藥效的物質(zhì)。所以中藥直接用于體外實驗因其科學性較差，難以得到認可。而血清藥理學的實驗方法克服了這些問題。血清藥理學是指將中藥、中藥復(fù)方以及不明成分的藥物給動物灌服一定時間后，采集動物血清，用此含藥成分的血清作為藥物源加入離體反應(yīng)系統(tǒng)中研究其藥理作用的實驗方法[1]。血清藥理學是日本學者Hiroko Iwama在1984年第一屆和漢醫(yī)學會上首次提出的，近年來，我國越來越多的中藥專家應(yīng)用此法來研究中藥藥理作用。從而避免了中藥體外用藥的干擾，直接反映中藥及其代謝產(chǎn)物的藥理作用。本文就關(guān)于血清藥理實驗的報道加以綜述。

1 實驗動物的選擇

常用實驗動物為小鼠、大鼠，也可用兔、豚鼠等。不同種屬的動物血清成分不同，所以應(yīng)盡量選用與人類生物學特性近似的物種[2]，從而縮小動物血清和人類血清在生理、生化等狀態(tài)下的差異，減少因種屬差異而造成的免疫反應(yīng)，提高實驗結(jié)果的可靠性[3]。在進行體外培養(yǎng)實驗時盡量采用同種血清，可以避免了多種血清的干擾[4]。由于動物在生理狀態(tài)下與病理狀態(tài)下對藥物消化吸收不同，對藥物生物轉(zhuǎn)化不同，藥物的作用下機體反應(yīng)不同，即正常動物采集的血清和病理狀態(tài)動物采集的血清的作用可能存在差異。有學者用兩種方法制備的清肝化瘀方藥含藥血清對人肝癌細胞增殖和凋亡的影響表明，發(fā)現(xiàn)病理狀態(tài)下和正常情況下大鼠制備的含藥血清對肝癌細胞的抑制作用不一樣，病理大鼠的含藥血清還能促進肝癌細胞凋亡。因此，需要根據(jù)各實驗要求選用不同的實驗動物和不同狀態(tài)下的實驗動物[5]。

2 給藥劑量

含藥血清加入到體外的實驗后，濃度會被稀釋，導(dǎo)致可能出現(xiàn)假陽性或者陰性的結(jié)果，當然，也并不能排除是否系由于藥物濃度過低造成的。給藥劑量=臨床常用量×動物等效劑量系數(shù)×培養(yǎng)基內(nèi)的稀釋度。這一方法的可以部分的彌補含藥血清在體外反應(yīng)系統(tǒng)中的被稀釋。缺點是血藥濃度并不能與給藥劑量呈等倍數(shù)增加，對藥味多、劑量大的復(fù)方在給動物灌服時可能有困難，達不到公式所要求的量；將含藥血清制成凍干粉，給實驗動物灌服，使之能夠在動物血中達到需要的濃度。這一方法可以根據(jù)實驗的需要，相應(yīng)的提高實驗動物血中的含藥濃度，并且有利于血清的貯藏保存。體內(nèi)給藥并不是劑量越大所得血清藥理效應(yīng)越好[6]，而是要考慮到臨床實際確定給藥劑量，隨意增加給藥劑量是非常危險的[7]。也有些人認為究竟采取什么劑量，最好是通過預(yù)試驗解決[8]。

3 給藥方案

在進行中藥血清藥理實驗之前必須確定合適的給藥方案[9]，是否禁食、給藥的次數(shù)以及給藥間隔都將會對血藥濃度產(chǎn)生影響。

食物可以改變胃腸道理化性質(zhì)，影響其功能狀態(tài)，減慢藥物在體內(nèi)的吸收過程，使血藥濃度達到實驗的要求的時間難以確定，甚至達不到實驗要求。因此在進行血清藥理實驗之前必須考慮是否禁食以及禁食時間的長短。一般情況下，應(yīng)在動物實驗前禁食8～12h，保持空腹狀態(tài)下進行實驗，避免其他因素帶來的干擾。崔曉蘭等發(fā)現(xiàn)3次給藥法，給家兔灌服桂枝湯，單次給藥后1、2、3h所采集的含藥血清無抑制副流感病毒致細胞病變的作用，但每日給藥1次，連續(xù)3d，末次給藥2h后的血清，有明顯抑制副流感病毒致細胞病變的作用。還有人提出每日1次連續(xù)7～10d給藥，每隔一個半衰期給藥一次，連續(xù)4～6次。采用中藥血清藥理學方法開展研究，有必要先確定受試制劑的給藥方案，這樣所取含藥血清才能較好反映藥物所具有作用[10]。這些方法的目的都是使血藥濃度達到穩(wěn)定再采血，從而便于藥物機制的研究。

4 采血時間

如果能在給藥的峰濃度時間段內(nèi)采血效果最好，能夠避免由于有效物質(zhì)尚未吸收或代謝殆盡而造成的假陰性結(jié)果。但是不同的藥物甚至同一藥物的不同有效成分，它們達到峰濃度的時間都不盡相同[11]。因此，采血很難有統(tǒng)一的標準。有研究者認為多數(shù)藥物的達峰時間在藥后1～2h，采血時間定為給藥后2h。也可在末次連續(xù)給藥后2次，間隔1h，第2次藥后1h采血。李儀奎則認為每日給藥2次，連續(xù)3d，末次給藥1h后采血。部分學者以含藥物血清抗血小板釋放5-HT和阻滯內(nèi)皮細胞鈣通道作用為指標，探討影響中藥血清藥理學方法開展的重要因素——制備含藥物血清的采血時間，并進行了時效關(guān)系的研究。結(jié)果顯示：給藥后30min采血所得血清作用最佳。達到近似穩(wěn)態(tài)血藥濃度時采血制備的含藥血清用來檢驗的效果最好[12]；最可靠的方法是先通過對少量動物進行預(yù)實驗，根據(jù)不同的實驗要求，將不同時間的采集的含藥血清進行實驗比較，再確定采血時間；梅彥芳[13]建議：含中藥或復(fù)方的血清制備，采血時間的確定還須考慮復(fù)方的劑型以及機體功能的狀態(tài)，并結(jié)合其藥效動力學參數(shù)來確定。

5 含藥血清的處理與保存

一般處理血清的方法有丙酮法、乙醇法、放置56℃水浴中、滅活30min。其中，水浴滅活最常用。血清中原來的蛋白質(zhì)、生物堿等生物活性物質(zhì)，它們會對體外培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生影響，血清滅活后可減少干擾因素對實驗的影響[14]。推薦進行體外抗病毒實驗時宜采用滅活血清較好[15]，以含桂枝湯兔血清經(jīng)56℃，滅活30min后用于實驗，發(fā)現(xiàn)正常血清及含藥血清滅活后對病毒致細胞病變的抑制作用較滅活前均有所降低。滅活的血清對實驗的不同影響，還取決于實驗對象的選擇，以及檢驗的目標[16]。可見，正常血清所含的抗體、補體等成分本身就有抗病毒作用。然而，用含頭風飲（TFY）血清研究血清滅活的影響時發(fā)現(xiàn)，以抗血小板釋放5-HT和阻滯內(nèi)皮細胞鈣通道作用為指標，血清滅活后使其藥效作用非但沒有降低，反而有所提高，但差異不明顯，說明在這個實驗中，血清在滅活對實驗結(jié)果的影響不大，可能與實驗所選動物、藥材有關(guān)系。然而這3種滅活方法對不同實驗，效果可能不同，周芝蘭等人以豚鼠離體氣管螺旋條抗乙酰膽堿及組織胺活性差異為指標，對血清預(yù)處理方法進行了比較，研究結(jié)果顯示，經(jīng)處理的血清均可非常明顯地降低血清的抗乙酰膽堿作用，并且經(jīng)丙酮處理的能明顯降低血清的抗組胺作用，經(jīng)56℃滅活血清不能降低其抗乙酰膽堿及抗組胺作用。還應(yīng)注意，血清經(jīng)長期的保存低溫保存后藥效會受到影響，所以進行血清藥理實驗時盡可能的使用保存時間較短的含藥血清或剛剛制備的含藥血清。

6 血清添加量

在用血清藥理實驗方法進行藥理學觀察時，必須注意到含藥血清加入體外反應(yīng)系統(tǒng)后，藥物濃度將被稀釋。在體外反應(yīng)系統(tǒng)中適當?shù)脑黾友逄砑恿渴强梢缘模x擇種屬越接近動物的血清，添加的濃度可以越高，添加濃度為100%時，即在純血清內(nèi)培養(yǎng)。隨著反應(yīng)體系中含藥物血清加入量的逐漸增加，其藥理效應(yīng)曲線是呈正態(tài)分布狀，說明并不是添加量越大越好，血藥濃度并不能與給藥劑量呈倍數(shù)的提高，給藥劑量加倍，血藥濃度不一定加倍。而且還應(yīng)考慮到受灌胃體積的限制。盡管不同的動物血清對細胞的影響是不同的，在進行細胞培養(yǎng)的時候，只選用一種血清也是可以的，既提供營養(yǎng)同時有作為藥物的載體，而且可以避免多種血清產(chǎn)生的干擾。

7 小 結(jié)

血清藥理學是一門較新的體外實驗方法，它優(yōu)于傳統(tǒng)的將中藥粗制劑直接加入反應(yīng)系的實驗方法，對中藥藥理機制的研究具有推動作用，為中藥復(fù)方的研究方法開辟了中藥研究的新思路。盡管這些年人們做了大量研究，但由于起步較晚，還有許多問題，如給藥方案、采血時間、血清的滅活等都需要探索和完善。中藥血清藥理學是針對中藥及其復(fù)方的中藥藥理研究方法，用含藥血清代替了傳統(tǒng)的中藥煎劑或提取物進行實驗，其科學性更強，可信度更高。相信隨著這門技術(shù)的日益成熟，中藥血清藥理學將會很好的發(fā)揮在科學研究和臨床應(yīng)用中的作用。

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