哺乳動物誘導多功能干細胞(iPSc)的技術研究進展①

郝蕭 楊秀霞 樊廷俊

(中國海洋大學海洋生命學院 山東青島 266003)

誘導型多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPS細胞)是通過在體細胞中轉入幾個特定的轉錄因子,實現體細胞核的重編程而獲得的可不斷自我更新且具有多向分化潛能的類胚胎干細胞樣細胞。2006年Takahashi 和Yamanaka[1]從與干細胞多能性維持相關的24個候選因子中篩選出4個轉錄因子組合Oct3/4、Sox2、c-Myc和KlF4,利用逆轉錄病毒轉染小鼠胚胎成纖維細胞和鼠尾成纖維細胞,成功誘導出小鼠iPS細胞。這一消息在生物學界引起了巨大轟動,國內外科學家們開始對iPS技術產生極大的興趣。正是因為iPS細胞與胚胎干細胞有相同的發育潛能,并且它的獲得不需要摧毀早期胚胎,從而避免引發倫理道德爭論,所以迄今研究iPS細胞的熱潮仍在持續,并且未來有可能替代胚胎干細胞用于臨床研究[2]。

1 iPS細胞誘導相關的轉錄因子

Oct4是胚胎發育多能性相關的轉錄因子,屬于POU轉錄因子家族中的一員,由Pou5f1基因編碼產生,它是全能性的標志,能夠促使內細胞團形成、維持ES細胞未分化前狀態并促進其增殖。因此,Oct4在維持干細胞多能性和干細胞的分化命運中起到重要作用[3]。

Sox2是Sox家族成員之一,也是胚胎發育早期多能性的一個標志基因,在內細胞團、外胚層和生殖細胞中有表達。Sox2與Oct4一樣對于維持干細胞的多能性狀態是不可或缺的[4]。

c-Myc是Myc癌基因家族的重要成員之一,具有增強細胞增殖的能力,并且促進腫瘤的發生。由于c-Myc具有引起iPS細胞產生腫瘤的風險,在重編程過程中去除該基因,結果發現誘導iPS細胞的重編程進程減慢,iPS細胞的形成效率顯著降低,并且推遲iPS細胞克隆的產生[5]。

KlF是屬于Kruppel樣因子的鋅指蛋白,具有癌基因屬性。在ESC自我更新過程中KlF4起著積極的作用,又有實驗表明,Klf4基因對于ES細胞的自我更新和未分化狀態的維持并不是必需的,可以由其他的一些轉錄因子或小分子取代[6]。

此外,Nanog和Lin28也是重編程過程中用到的轉錄因子。綜上,實現重編程的4個轉錄因子中,Oct4一直被認為是重編程過程中不可缺少,在重編程起始過程中起到重要作用。而Sox2往往作為Oct4的協作因子對ESCs中的下游靶基因進行調控,二者是維持胚胎干細胞特征所必須的轉錄因子。而Klf4和c-Myc作為癌基因,在重編程過程中其可能的作用是使成熟細胞產生腫瘤樣轉變,賦予細胞無限增殖以及快速生長的能力,都可被同一蛋白家族的其它成員所替代,因此Klf4和c-Myc可能并非是重編程過程所必需的因子。

2 iPS技術的研究進展

繼2006年Takahashi[1]首次建立了小鼠iPS細胞以來,iPS的研究雖然發展比較迅速,但是也存在許多問題和困難,如病毒介導的轉基因可能會整合入宿主細胞的基因組;誘導過程中使用致瘤基因致瘤;誘導iPS細胞的產生效率低等。這些無疑將嚴重阻礙iPS細胞的實際應用。因此,如何有效地提高病毒轉染的效率和安全性是我們亟待解決的問題。誘導iPS細胞的方法分為以下幾種。

2.1 整合方式

2.1.1 逆轉錄病毒載體 最初是利用逆轉錄病毒載體[7]表達4個重編程因子,然后將細胞在ES細胞培養液中培養,用多能性標志分子Fbx15的表達對轉染后的細胞進行篩選,得到與ES細胞形態相似的克隆體(即iPS細胞)后,這些iPS細胞能夠表達ES細胞的特異性標志基因,將得到的iPS細胞皮下注射免疫缺陷型小鼠可以使其發生含有3個胚層的畸胎瘤,將iPS細胞注射到小鼠囊胚中也可形成嵌合體,但是仍然沒有得到成活的嵌合體小鼠。這種傳統的方法存在誘導效率很低和細胞多能性不均一等不足;并且還存在內在安全問題,不管是逆轉錄病毒,還是慢病毒,都會把外源基因整合到基因組DNA中,這就有可能引起宿主基因組的插入突變。由于轉錄因子中c-Myc和Klf4具癌基因屬性,它們可以使誘導的多功能干細胞后代小鼠形成腫瘤。Nakagawa等[8]嘗試了去掉c-Myc因子,只用Oct4,Sox2和Klf43個因子來誘導iPS細胞,雖然效率有所降低,但是得到的iPS后代小鼠在出生100d后沒有腫瘤形成。最近研究發現一些小分子化合物可以通過調控細胞內源性重編程基因的表達量,來替代這4種重編程因子中的部分因子行使誘導功能以及提高誘導效率,如組蛋白脫乙酰基酶抑制劑-丙戊酸(VPA),它可以誘導基因組水平的乙酰化,促使細胞具有松弛的染色體結構,這種結構對結合異位表達的轉錄因子或者下游次級轉錄因子是有利的,通過小分子化合物提高重編程效率的同時還可以有助于減少參與重編程所需因子的數量,能夠同Oct4和Sox22種因子一同作用即可誘導原代人成纖維細胞重新編程為iPS細胞[9],大大降低了iPS細胞的致癌性,同時使誘導效率提高了100倍。

2.1.2 2A肽段序列和IRES技術 為了提高安全性,降低病毒的整合效率,Carey等[7]通過引入自剪切多肽2A序列和核糖體進入位點IRES序列,將轉錄因子用一個簡單的慢病毒載體實現同步表達,減少了宿主細胞中的病毒載體的數量,從而降低了插入突變的概率。引入自剪切多肽2A序列是指在4種重編程因子之間分別插入3種不同的2A序列;同時引入2A序列和IRES序列是指在Oct4與Klf4通過F2A連接在一起的順反子和Sox2與c-Myc通過E2A連接的順反子之間插入IRES序列。2種方法相比,僅用自剪多肽2A序列連接的4個轉錄因子在表達時容易引起下游順反子較低水平的表達,而插入IRES序列的多順反子載體可以克服這種上游與下游順反子表達量的差異。

2.1.3 Cre/LoxP重組系統 還可以采用Cre/LoxP重組系統來切除整合的外源重編程因子,以獲得iPS細胞[10]。Cre重組酶是一種位點特異性重組酶,能介導2個LoxP序列之間的特異性重組,使LoxP位點之間的基因序列被刪除或重組。LoxP序列來源于P1噬菌體,是有2個13bp反向重復序列和中間間隔的8bp序列共同組成,8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結合,LoxP序列的13bp反向重復序列是Cre酶的結合域。如果2個LoxP序列位于一條DNA鏈上,且方向相同,Cre重組酶能有效切除2個LoxP位點間的序列。但盡管如此,載體的一段DNA還留在插入位點上,因此仍然無法避免插入突變。

2.1.4 線性化的質粒和piggyBac(PB)轉座子 為了降低插入突變,可以用線性化的質粒和piggyBac(PB)轉座子介導表達4個重編程因子,強力霉素誘導并建立iPS細胞系,然后在這些iPS細胞中瞬時表達可以切除這4種外源重編程因子的轉座酶,誘導產生的iPS細胞就不再表達外源重編程因子,安全性有所提高。PB轉座子兩端各有一個連著可以瞬時表達插入或切除功能的轉座酶基因的反向重復序列,具體方法是將4種重編程因子插入到含有四環素或強力霉素啟動子的PB-TET轉座子質粒中,轉染小鼠胚胎纖維母細胞,用反式四環素激活蛋白激活誘導iPS后,PB轉座子系統翻譯表達的轉座酶可將外源DNA徹底清除,并不引起基因組DNA序列的任何變化[11]。相對Cre介導的基因切除而言,PB轉座子系統是一種更安全的建立iPS細胞系的方法。

2.2 非整合方式

2.2.1 腺病毒載體 從誘導iPS細胞的分子機制方面來看,通過導入外源轉錄因子基因,其表達產物可激活內源的Oct4、Sox2等轉錄因子基因,從而開啟基因組的重編程過程,也就說明iPS細胞無需病毒載體整合進宿主基因組,只需外源轉錄因子的瞬時表達,激活內源性轉錄因子,此后iPS細胞多潛能性靠內源性轉錄因子表達來維持,而不再需要外源基因的誘導與維持。由于iPS細胞的形成需大約10～12d的持續表達重編程因子,因此,對瞬時表達的持續時間要求至少為10d。Stadtfeld等[12]為了避免造成基因組插入突變,采用腺病毒載體來介導重編程因子的轉染小鼠纖維母細胞和肝細胞來誘導iPS細胞,并成功獲得了沒有外源基因整合的iPS細胞。

2.2.2 脂質體介導 Okita等[13]采用脂質體介導的轉染方法來誘導鼠的胚胎纖維母細胞iPS細胞,由于質粒載體在細胞培養過程中容易被稀釋和退化,所以設計了2種載體,一種是含Oct3/4、Sox2、Klf4的多順反子載體,另一種是含有c-Myc的單獨質粒,反復交替轉染這2種載體,以保證重編程因子在重編程的前期持續表達,但誘導iPS細胞的效率很低。此外非整合型附著體載體腺病毒載體也被用于小鼠纖維原細胞和肝臟細胞iPS細胞的誘導,該方法同樣存在效率低的問題。

2.2.3 重組蛋白 上述方法都是對細胞進行了基因水平的操作,近年來有研究通過導入重編程因子的編碼蛋白的方法來誘導iPS細胞的形成。蛋白轉導誘導多功能干細胞方法的建立標志著iPS研究的又一重大的突破。轉導所用的重編程蛋白是原核表達表達的修飾了的重組蛋白,即將細胞穿膜肽序列連接到重編程因子的C末端上,由于細胞穿膜肽是一類攜帶大分子物質穿過細胞膜進入細胞的小分子多肽,這樣的重組子表達的重組蛋白就可以直接穿過細胞膜進入到細胞進而進入細胞核,從而啟動細胞重編程過程,目前,重組蛋白誘導的小鼠和人iPS細胞都已成功建立[14～15]。重組蛋白誘導iPS細胞的方法因為不涉及任何改變細胞遺傳信息的風險,所以是目前所有研究方法中最為安全和可行的。

2.2.4 mRNA 利用mRNA替代DNA,產生重新編碼細胞所需的4種蛋白質。通過電穿孔或者陽離子載體將4個關鍵蛋白質的mRNA導入細胞,從而誘導細胞改變原有程序而轉變成iPS細胞,這種方法使細胞重新編程的速度和效率大大提高,只用以前的一半的時間大約只有17d,而效率是以前標準方法的100倍以上[16]。

此外,這種誘導轉化而成的iPS細胞沒有發生癌變情況,而其功能卻基本等同與胚胎干細胞。它比傳統的誘導多能干細胞更像胚胎干細胞,因為它們沒有被改變基因。他們未來的目標是能夠在未來使用干細胞充當新健康細胞的來源以取代被疾病破壞的細胞。

3 iPS細胞的應用研究

由于iPS細胞可由自體細胞誘導產生,因而應用在疾病治療方面不存在免疫排斥現象,所以相比之下iPS細胞比ES細胞有更廣的應用性。在再生醫學、臨床醫學、組織工程和藥物學等方面都有極大的應用價值,必將成為生命醫學領域的一個重要研究方向。將來自患者的體細胞表達外源重編程因子以誘導產生iPS細胞,通過遺傳修飾改正有缺陷的基因,再分化得到功能正常的所需要的細胞,以進行細胞移植治療,比如分化產生正常功能的運動神經元來治療肌萎縮側索硬化癥[17]。

iPS的研究持續高漲,并取得了許多令人矚目的成績,但仍有許多問題需要搞清楚,比如體細胞核重編程的具體機制,iPS細胞與胚胎干細胞究竟有無差異,如何實現iPS細胞的定向誘導等等,仍然需要進一步的探索。但毋庸置疑的是iPS技術必定會給干細胞研究領域注入新的活力。

[1] Takahashi K.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663～676.

[2] Kehat I.Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and function properities of cardiomyocytes[J].ClinInvest,2001,108:407～414.

[3] Stadfeld M.Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell rep rogramming in mouse[J].Cell Stem Cell,2008,2(3):230～240.

[4] 陳艷玫.轉錄因子Sox2的研究進展[J].生命科學,2004,16(3):

129～134.

[5] Nakagawa M.Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts[J].Nat Biotechnol,2008,26:101～106.

[6] Shi Y.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds[J].Cell Stem Cell, 2008,3:568～574.

[7] Carey B W.Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector[J].ProcNatl Acad Sci U S A,2009,106:157～162.

[8] Nakagawa M. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts[J].Nat Biotechnol,2008,26:101～106.

[9] Danwei Huangfu.Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2[J].Nature,2008.

[10]Soldner F. Parkinson?ˉs disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors[J].Cell,2009,136:964～977.

[11]Woltjen K.piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells[J].Nature,2009,458:766～770.

[12]Stadtfeld M.Induced pluripotent stem cells generated without viral integration[J].Science,2008,322:945～949.

[13]Okita K.Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors[J].Science,2008,322:949～953.

[14]Zhou H.Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins[J].Cell Stem Cell,2009,4:381～384.

[15]Kim D.Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins[J].Cell Stem Cell,2009,4:472～476.

[16]Luigi W. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA[J].Cell Stem Cell,2010:1～13.

[17]Dimos J T.Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons[J].Science,2008,321:1218～1221.