先天性人巨細(xì)胞病毒肝炎小鼠模型的建立

張 俐,彭 麗,李德麗,孟繁崢

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科,吉林長(zhǎng)春 130021）

人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV）感染在全世界分布,可引起肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等多系統(tǒng)的病變,其中肝臟最常受累及。先天性巨細(xì)胞病毒感染的新生兒中,常見(jiàn)的癥狀包括病理性黃疸、高膽紅素血癥、肝脾腫大,有些患兒甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的肝功能損傷,發(fā)展為肝硬化、肝衰竭而死亡。其發(fā)病機(jī)制的深入探討與治療藥物的篩選與評(píng)價(jià),很大程度上依賴(lài)于先天性巨細(xì)胞病毒肝炎模型的建立與應(yīng)用,通過(guò)建立科學(xué)性、實(shí)用性、重現(xiàn)性良好的實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型,對(duì)篩選保肝藥物,探索保肝作用原理,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究將HCMV經(jīng)腹腔接種的方式感染生育齡Balb/c雌雄小鼠并配對(duì)喂養(yǎng)。在繁殖后,取新生鼠肝組織進(jìn)行病毒分離、病理學(xué)檢查及原位雜交檢測(cè)。結(jié)果提示:HCMV可垂直傳播給子代,使新生鼠肝臟發(fā)生病理改變,在肝組織中可分離到該病毒;原位雜交檢測(cè)顯示,病毒核酸存在于受該病毒感染細(xì)胞的核內(nèi)及胞漿內(nèi)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康純系BALB/C鼠,雌雄各半,10周齡,體重約25-30 g。購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 病毒和細(xì)胞

HCMV AD169標(biāo)準(zhǔn)株、人胚肺成纖維細(xì)胞(HEL）由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室提供。使用前將病毒在HEL細(xì)胞上15-20次傳代,以增加病毒毒力;經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn),以6.0log TCID50/ml的病毒作為實(shí)驗(yàn)用毒種。

1.3 主要試劑

主要化學(xué)試劑及分子生物學(xué)試劑購(gòu)自北京華美生物工程公司、武漢博士德試劑公司等。

1.4 方法

10周齡健康BALB/C雌鼠50只,雄鼠50只,隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組,雌雄各25只,隨機(jī)配對(duì)。將HCMV AD169株懸液分別腹腔內(nèi)注射給感染組雌雄鼠,劑量為6.0 log TCID50/只;將細(xì)胞維持液腹腔內(nèi)注射給對(duì)照組小鼠,劑量為1.0 ml/只。在雌鼠分娩后取新生小鼠肝組織進(jìn)行病毒分離和病理、原位雜交檢測(cè),每項(xiàng)檢測(cè)隨機(jī)選取感染組和對(duì)照組新生小鼠各30只。

1.4.1 病毒分離 病毒分離常規(guī)無(wú)菌操作下取出新生鼠肝臟制備肝細(xì)胞懸液,低速離心后,取上清直接接種至HEL細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照。對(duì)出現(xiàn)HCMV特征細(xì)胞病變作用者,取培養(yǎng)上清做PCR,檢測(cè)HCMV DNA。

1.4.2 病理學(xué)分析 取新生鼠肝組織進(jìn)行病理學(xué)分析,用4%甲醛固定新生屬肝組織,常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片,光學(xué)病理學(xué)檢查組織病理變化。

1.4.3 原位雜交檢測(cè) 原位雜交檢測(cè)HCMV探針來(lái)自HCMVLA2099-2500 bp(與其他病毒基因無(wú)同源序列,地高辛標(biāo)記）。將感染組和對(duì)照組新生鼠肝臟組織石蠟切片脫蠟、滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,暴露DNA,100℃核酸變性,加預(yù)變性HCMV DNA探針雜交液37℃孵育過(guò)夜,加生物素化地高辛抗體,進(jìn)行親和素-辣根過(guò)氧化物酶-DAB顯色,蘇木素復(fù)染,光鏡下檢查細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色著色者判為HCMV陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 新生小鼠肝組織病毒分離結(jié)果

將30份感染組新生小鼠肝組織制成的肝細(xì)胞懸液,經(jīng)不同方式處理后接種細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。發(fā)現(xiàn)HEL細(xì)胞的細(xì)胞病變作用主要有如下表現(xiàn):細(xì)胞腫脹,核變大,形成巨大細(xì)胞,折光性增強(qiáng),核內(nèi)及胞漿內(nèi)產(chǎn)生大型嗜酸性或嗜堿性包涵體,這些包涵體有暈輪圍繞并與核膜分離。為了進(jìn)一步確定結(jié)果,用PCR法對(duì)HEL單層細(xì)胞分離培養(yǎng)陽(yáng)性者檢測(cè)HCMV-DNA,亦均得到陽(yáng)性結(jié)果。證明了HCMV可經(jīng)胎盤(pán)垂直傳播至子代小鼠。對(duì)照組新生小鼠肝組織HEL單層細(xì)胞分離培養(yǎng)以及PCR檢測(cè)均為陰性。

2.2 病理學(xué)研究

感染組:組織結(jié)構(gòu)大致正常,肝組織中常有點(diǎn)狀或灶狀的壞死,巨核細(xì)胞可見(jiàn)。壞死區(qū)和匯管區(qū)均可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。核內(nèi)可見(jiàn)“貓頭鷹眼”樣細(xì)胞,是由于包涵體偏于一端使細(xì)胞呈現(xiàn)貓頭鷹眼樣的改變,。局部肝臟的包膜不同程度增厚。而對(duì)照組:肝組織結(jié)構(gòu)正常,個(gè)別新生鼠的匯管區(qū)見(jiàn)少數(shù)炎細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞有點(diǎn)狀壞死。

2.3 原位雜交技術(shù)檢測(cè)新生小鼠肝細(xì)胞中HCMV DNA

原位雜交技術(shù)檢測(cè)新生小鼠肝細(xì)胞中HCMV DNA HCMV DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在感染組新生小鼠肝細(xì)胞(14/30）陽(yáng)性率為46.67%。對(duì)照組均未見(jiàn)陽(yáng)性的著色。

3 討論

HCMV感染比較廣泛,有研究表明,CMV在嬰兒中的感染率為68.0%[1]。該病毒可長(zhǎng)期潛伏在體內(nèi),在免疫力減退、胎兒和小嬰兒時(shí)期可使多系統(tǒng)、多臟器受累,出現(xiàn)肝炎、貧血、肺炎等,其中以肝損害相對(duì)常見(jiàn)且明顯[2]。在嬰幼兒肝炎中有50%為CMV感染[3]。近年來(lái),隨著病毒學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)及臨床病理學(xué)研究的發(fā)展,CMV感染所致的肝損害的問(wèn)題日益受到重視。因此,通過(guò)有效地對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行病毒接種干預(yù),建立HCMV先天性感染導(dǎo)致肝臟損傷的模型,從而對(duì)HCMV感染的藥物治療、預(yù)防及其他方面的研究具有重要意義。該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的設(shè)計(jì)應(yīng)盡量模擬臨床疾病的病理過(guò)程,所以建立模型的重要原則之一應(yīng)是所建立的新生鼠肝炎模型盡量與人類(lèi)感染HCMV后的情況相似。既往較多應(yīng)用鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV）感染小鼠模型來(lái)作研究HCMV感染。但是,HCMV可以通過(guò)胎盤(pán)使處于發(fā)育中的胚胎發(fā)生先天性感染[4],而小鼠經(jīng)自然途徑被MCMV感染卻不能通過(guò)胎盤(pán)感染子代。因此,MCMV對(duì)于此項(xiàng)研究并不十分適合。

本文將HCMV AD169株接種至生育齡雌雄BALB/C小鼠腹腔內(nèi),可以導(dǎo)致成年鼠HCMV原發(fā)性感染,但由于此年齡段雌鼠可發(fā)生病毒血癥,卻因?yàn)閷?duì)病毒有一定程度的防御抵抗能力而不發(fā)病、不死亡。這種情形與人類(lèi)大多數(shù)孕婦原發(fā)感染HCMV時(shí)常無(wú)任何臨床癥狀相似;但病毒卻可經(jīng)胎盤(pán)傳給胎兒。HCMV被認(rèn)為具有較嚴(yán)格的種屬特異性,但HCMV AD169株作為標(biāo)準(zhǔn)毒種已在體外廣泛傳代并冷藏多年;HCMV可經(jīng)小鼠胎盤(pán)垂直傳播至胎兒的腦組織已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)[5]。結(jié)果表明,BALB/C小鼠用于HCMV先天性感染致新生鼠肝炎模型的優(yōu)點(diǎn)如下:(1）BALB/C小鼠個(gè)體差異小,遺傳背景均一,基因改造技術(shù)成熟,且生理生化和發(fā)育與人類(lèi)相似,試驗(yàn)結(jié)果精確可靠,與鼠相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型、免疫球蛋白、細(xì)胞因子等試劑已商品化,繁殖快,費(fèi)用和飼養(yǎng)要求低。因此具有較高的可行性、可重復(fù)性和經(jīng)濟(jì)性。(2）感染小鼠分娩新生鼠模擬了HCMV在自然宿主中的一些主要先天性感染特征;使該疾病動(dòng)物模型與人類(lèi)疾病具有較高的相似性。(3）在新生小鼠肝組織的細(xì)胞水平和分子水平上均證實(shí)有HCMV感染存在;故該模型研究所獲資料可以證實(shí)人類(lèi)HCMV的垂直傳播導(dǎo)致肝炎。

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