HPLC測定宮炎康顆粒中阿魏酸的含量

劉倩 丁秋玲 包莉 張鳳龍

宮炎康顆粒處方由當歸、川芎、赤芍、香附、紅花、延胡索等十二味中藥材組成，為中華人民共和國衛生部藥品標準《中藥成方制劑》第二十冊所收載，具有活血化瘀，解毒消腫的功效，用于慢性盆腔炎等癥。原標準中僅有芍藥苷的薄層鑒別[1]，由于當歸、川芎為方中君藥，其有效成分均為阿魏酸，其作為一種指示性的化合物[2]，在藥材中含量相對較易測定。有關阿魏酸含量測定報道的方法有薄層掃描法[3]、高效毛細管電泳法[4]和高效液相色譜法[5-8]等，由于宮炎康顆粒處方成分復雜、含糖量高，測定時干擾較大，因此筆者采用了多次萃取分離并用高效液相色譜法測定該制劑中阿魏酸含量的方法，該法可有效排除干擾物質，雜峰很少，靈敏度高，結果準確可靠。

1 儀器、試藥和色譜條件

1.1 儀器與試藥 日本島津LC-10Ap高效液相色譜儀、SPD-10AP紫外檢測器。浙江大學N2000色譜工作站，AEU-200電子天平(日本島津);CBID960A超聲波清洗器(上海科導超聲儀有限公司)，TU-1810紫外可見分光光度計。

阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110773-9910)，實驗中中藥材均購于常州安泰大藥房，經鑒定均為藥典正品;宮炎康顆粒(自制，批號:20101001，20101002，20101003);乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件 色譜柱:KromasilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈-水(H3PO4調 PH 至2.5)(20:80)，流速:0.8 ml/min;檢測波長為313 nm;柱溫:25℃。理論塔板數按阿魏酸峰計，不應低于3000。

2 方法與結果

2.1 供試品提取方法的選擇

2.1.1 供試品提取溶劑的選擇 取本品研細，取3份，每份3 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，分別加甲醇、甲酸-甲醇(5∶95)溶液、乙酸乙酯各40 ml，超聲提取30 min，放冷，再分別加甲醇、甲酸-甲醇溶液、乙酸乙酯至刻度，搖勻，濾過，取續濾液25 ml，蒸干，殘渣加5%碳酸鈉溶液20 ml溶解，用乙醚萃取3次，每次20 ml，棄去乙醚液，用鹽酸調水層至PH=2，再用乙醚提取3次，每次20 ml，合并乙醚提取液，揮干，殘渣用流動相溶解并定容至5 ml棕色量瓶中，搖勻，分別作為供試品溶液。

精密吸取上述三種供試品溶液和對照品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，照上述色譜條件測定阿魏酸的峰面積，并計算含量，三種溶劑提取的阿魏酸含量基本一致，但通過觀察峰中雜質的數量，發現以甲酸-甲醇為溶劑提取的供試品峰的雜質峰數量最少，且分離效果最好，有利于色譜柱的保養維護，故選擇甲酸-甲醇(5∶95)為提取溶劑。

2.1.2 萃取次數的選擇 取本品研細，取3 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液40 ml，超聲提取30 min，放冷，定容，搖勻，濾過，取續濾液 25 ml，蒸干，殘渣加5%的碳酸鈉溶液20 ml溶解，用乙醚萃取3次，每次20 ml，棄去乙醚液，用鹽酸調水層至PH=2，再用乙醚提取4次，每次20 ml，1、2次提取液合并，第3次、第4次分別另置，分別揮干乙醚液，殘渣用流動相溶解，1、2次轉移并定容至5 ml棕色量瓶中，第3、4次分別轉移并定容至2 ml棕色量瓶中，搖勻，即得。

分別精密吸取上述3種溶液及對照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，照上述色譜條件測定阿魏酸的峰面積，計算含量，結果表明:萃取3次，才能將阿魏酸萃取完全。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品約10 mg，精密稱定，置100 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 ml溶液含阿魏酸10 μg)。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品約3 g，研細，精密稱定，置50 ml量瓶中，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液40 ml，超聲提取30 min，放冷，定容，搖勻，濾過，取續濾液25 ml，蒸干，殘渣加5%的碳酸鈉溶液20 ml溶解，用乙醚萃取3次，每次20 ml，棄去乙醚液，用鹽酸調水層至 PH=2，再用乙醚提取3次，每次20 ml，合并乙醚提取液，揮干，殘渣用流動相溶解并定容至5 ml棕色量瓶中，搖勻，即得。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀中測定。

2.3 專屬性實驗 取缺當歸、川芎的其余藥材，按照處方量和制備工藝制成陰性顆粒，并按上述供試品制備方法制成陰性對照液，分別精密吸取對照品溶液、陰性溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀中測定，結果陰性無干擾。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取阿魏酸對照品溶液(濃度為 10.2 μg/ml)2，6，10，14，18 μl，按上述色譜條件進行測定，以峰面積積分值(Y)為縱坐標，阿魏酸進樣量(x)為橫坐標，進行線性回歸，得標準曲線Y=49531.9x+36973.2r=0.9997。表明阿魏酸在20.4～183.6ng之間，峰面積與其含量呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液10 μl，重復進樣5次，按上述色譜條件測定各峰面積，結果阿魏酸的平均峰面積為537791，RSD為0.89%，表明儀器精密度良好。

2.6 重現性試驗 精密稱取同一批號的樣品(20101028)共5份，依照供試品溶液制備方法進行制備，按上述色譜條件測定并計算含量，5份樣品中阿魏酸的含量平均為0.314 mg/袋，RSD為1.79%，說明該方法重現性良好。

2.7 穩定性試驗 取與重現性試驗同一供試品溶液，在8 h內每隔2小時分別進樣10 μL，并測定峰面積，結果RSD為1.82%，表明樣品溶液在8 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收試驗 取同一批號的樣品5份，各約1.5 g，精密稱定，于每份中加入5 ml的上述阿魏酸對照品溶液(10.2 mg/ml)，依法提取，進樣10 μl，計算回收率，得平均回收率為98.65%，RSD為1.00%，說明回收良好。

3 討論

3.1 色譜條件的確定 對于阿魏酸的檢測波長，《中國藥典》[5]一部中采用的為316 nm，本實驗將阿魏酸用甲醇配制每1 ml含10.2 μg的溶液，以流動相為空白，置紫外可見分光光度計中，從200～400 nm掃描，結果阿魏酸在313 nm波長處有最大吸收峰，流動相在313 nm附近無吸收。故本實驗檢測波長選擇313 nm。流動相的選擇參考文獻[6-8]，對不同比例的乙腈-0.085%磷酸溶液、甲醇-1%冰醋酸水溶液、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-1%冰醋酸水溶液進行了測試，用乙腈-0.085%磷酸溶液必須在35℃下測定時阿魏酸分離效果好，而改進后用乙腈-水(用H3PO4調PH至2.5)在常溫下測定時阿魏酸分離效果就很好，所以選其作為本品的流動相。

3.2 在對提取方法的選擇時，曾采用冷浸過夜、超聲30 min、回流1 h三種不同的提取方法進行比較，結果冷浸過夜提取不完全;回流提取雜質干擾大;超聲30 min提取最為理想，其色譜峰符合要求。

3.3 采用流動相作樣品的稀釋劑，可避免因流動相與樣品稀釋劑的不同，使樣品中某些成分在流動相中析出而導致堵塞管路的可能性。同時，阿魏酸不穩定，見光易分解，應放在棕色容量瓶中避光保存，且須當天配制當天測定。

[1]衛生部藥品標準.WS3-B-3921-98.

[2]胡益勇，徐曉玉.阿魏酸的化學和藥理研究進展.中成藥，2006，28(2):253-255.

[3]都述虎，金繼曙.腦復清膠囊中阿魏酸的含量測定研究.中國現代應用藥學，2001，18(1):59-60.

[4]李喜鳳，邱天寶，胡亞楠，等.高效毛細管電泳法測定蒲公英中阿魏酸的含量.中國實驗方劑學雜志，2010，16(16):27-29.

[5]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典:2010年版(一部)，2010:124.

[6]劉義梅.HPLC法測定復方銀杏口服液中阿魏酸的含量.中藥材，2005，28(2):147-148.

[7]董文桑，瞿發林.HPLC法測定鎮痛寧膠囊中阿魏酸含量.中國藥師，2009，12(3):359-360.

[8]方寶霞，李鵬，時曉亞，陳富超.高效液相色譜法測定生化膏中阿魏酸含量.藥物鑒定，2010，19(13):30-31.