茯苓多糖對點帶石斑魚非特異性免疫力的影響

王慶奎 趙海運 陳成勛 呂志敏 邢克智

中草藥多糖是一種免疫增強劑，能夠增強水產動物的非特異性免疫功能，提高機體抗病力，與抗生素和化學消毒劑相比具有無藥物殘留、無污染以及病原菌不產生抗藥性等優點[1]。茯苓為中國傳統中草藥，為多孔菌科植物茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，《神農本草經》中又名茯菟。茯苓味甘、淡，性平，歸心、肺、脾、腎經，具有利水滲濕，健脾和中，具有寧心安神之功效[2]。茯苓多糖(pachyman)是茯苓的主要活性成分，含量可達茯苓干重的84%，具有抗腫瘤[3]、抗病毒[4]、抗炎[5]、抗衰老[6]和增強免疫力[7]作用。茯苓多糖經化學修飾后能增強其生物學活性[8-9]。

目前，茯苓多糖對人類和畜禽動物的影響及其機制研究得較多，而在水產養殖上的研究報道較少[10-11]。本試驗研究茯苓多糖對點帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)非特異性免疫力的影響，為茯苓多糖在水產飼料中的應用提供參考。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料

健康點帶石斑魚幼魚由天津市海發珍品實業有限公司提供。茯苓多糖購自山東圣旺藥業股份有限公司，多糖含量50%。

1.2 試驗設計及方法

在基礎餌料中分別添加0、50、200、350、500 mg/kg的茯苓多糖，制成5種試驗餌料。基礎餌料配方和營養水平見表1，復合維生素和復合礦物質按暖水性魚類營養需求添加[12]。各原料粉碎后過60目篩，逐級擴大法混合均勻，揉成面團后用絞肉機擠成直徑2 mm的面條，風干后搓碎，-18℃保存備用。將馴化1周后的點帶石斑魚幼魚[(83.25±8.94)g]隨機分配到30個水族箱（860 mm×620 mm×455 mm）中，每箱30尾。每種餌料投喂6箱。每種餌料每7 d尾靜脈采血1次，每次取3箱，每箱15尾，采血前停食1 d。測定血液中的非特異性免疫指標。

試驗魚采用微流水(3.6 L/min)養殖。試驗期間水質條件：水溫26～28℃，鹽度28～30，溶解氧＞5.6 mg/l，-N＜1.1 mg/l，NO2-N＜0.3 mg/l。日換水3次，換水時清除糞便。日投餌2次，每次飽食投喂。

1.3 測定指標及測定方法

試驗魚用MS-222麻醉后，用一次性無菌注射器尾柄采血，一部分置離心管中離心得血清，-86℃保存，另一部分用肝素鈉抗凝，計數血液中的白細胞數和白細胞吞噬能力。測定血清中酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、溶菌酶(lysozyme,LZM)活力，總蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,A)含量，補體C3和C4含量。ACP、TP和A均用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定。白蛋白/球蛋白（A/G）=A/(TP-A)[13]。

表1 基礎餌料配方（%）

1.3.1 LZM的測定

將活化后的溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）用PBS（pH值6.4）調濃度為OD570≈0.3，取150 L菌懸液均勻涂布在固體培養基上。在培養基上等間距放置直徑4.32 mm滅菌濾紙片，向濾紙片中心滴加濃度分別為375、750、1 125、1 500、1 875、2 250 U/ml的溶菌酶標準品溶液10 μl，置28℃培養箱中倒置培養12 h后測量抑菌圈直徑。以抑菌圈直徑為X值，溶菌酶標準品濃度的對數為Y值求回歸方程。取10 μl血漿加在濾紙片上，按上述方法孵育，測量抑菌圈直徑。將抑菌圈直徑代入回歸方程，算出血漿中溶菌酶活力。

1.3.2 血液白細胞計數

抗凝血用白細胞稀釋液稀釋100倍后，在顯微鏡下用血球計數板計數。白細胞稀釋液配制：98 ml蒸餾水加入1%亞甲藍3滴、冰醋酸2 ml，配制成100 ml白細胞稀釋液。血液白細胞數(個/L)=5個大方格中白細胞數×50 000×1 000×稀釋倍數。

1.3.3 血液白細胞吞噬能力

在200 μl抗凝血中加50 μl濃度為4×107cfu/ml枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）懸液，混勻后28℃孵育30 min，每10 min搖勻1次。孵育結束后涂血涂片，吉姆薩染液染色后油鏡下每尾魚計數100個白細胞吞噬情況。按下列公式計算吞噬率（PR）和吞噬指數（PI）。

吞噬率（%）=（吞噬枯草芽孢桿菌的白細胞數/白細胞數）×100；

吞噬指數=被吞噬的枯草芽孢桿菌數／吞噬枯草芽孢桿菌的白細胞數。

1.4 數據統計

試驗數據用“平均數±標準誤”表示，數據用Excel和SPSS13.0軟件處理，做單因素方差分析，若差異顯著(P＜0.05)時用Duncan's法作多重比較。表中數據用平均值±標準誤表示（n=5）。

2 結果與分析

2.1 血清ACP活力（見表2）

茯苓多糖對點帶石斑魚血清中ACP活力影響不明顯，僅50 mg/kg組在喂食21 d后顯著高于對照組。

表2 點帶石斑魚血清ACP活力(U/100 ml)

2.2 血清A/G值（見表3）

試驗組飼喂茯苓多糖14 d A/G值低于對照組，除50 mg/kg組與對照組相比差異不顯著外，其它組與對照組相比差異均顯著。飼喂茯苓多糖7 d、21 d和28 d血清A/G值與對照組相比差異不顯著。

表3 點帶石斑魚血清A/G值

2.3 血清補體C3和C4含量（見表4）

飼喂茯苓多糖能提高補體C3含量，50 mg/kg組在第21 d顯著高于對照組，200 mg/kg組在第21 d、28 d顯著高于對照組，350 mg/kg組在第14 d、28 d顯著高于對照組。500 mg/kg組在飼喂28 d內與對照組差異不顯著。茯苓多糖對補體C4含量影響不明顯，僅200 mg/kg組在第21 d顯著高于對照組。

表4 點帶石斑魚血清中補體C3、C4含量(g/l)

2.4 血清LZM活力（見圖1）

茯苓多糖對點帶石斑魚血清LZM活力影響不顯著（P＞0.05）。

圖1 茯苓多糖對點帶石斑魚血清LZM的影響

2.5 血液白細胞數（見表5）

表5 茯苓多糖對點帶石斑魚血液白細胞數的影響(×1011個/ml)

飼喂茯苓多糖7 d能提高血液白細胞數，50、200和500 mg/kg組白細胞數顯著高于對照組。50 mg/kg組白細胞數在第14 d顯著高于對照組。在第21 d、28 d茯苓多糖對白細胞數影響不顯著。

2.6 血液白細胞吞噬能力（見表6）

茯苓多糖能提高血液白細胞PR，其中50 mg/kg組在第21 d、28 d PR顯著高于對照組，200 mg/kg組在第7 d顯著高于對照組，350 mg/kg組在第21 d、28 d顯著高于對照組。茯苓多糖能降低血液白細胞PI，各組PI在第7 d、21 d均顯著低于對照組。

表6 茯苓多糖對點帶石斑魚血液白細胞吞噬能力的影響

3 結論

飼喂茯苓多糖能降低點帶石斑魚血清A/G值、提高血清補體C3含量、提高血液白細胞數和白細胞PR，茯苓多糖對血清ACP活力、LZM活力和補體C4含量影響不明顯，但能降低血液白細胞PI。建議點帶石斑魚飼料中茯苓多糖添加量為50～200 mg/kg，連續喂食28 d。

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