熱休克蛋白70的生物學(xué)功能及其誘導(dǎo)劑
——谷氨酰胺在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

孫培明

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）或熱應(yīng)激蛋白（heat stress protein，HSP）是機(jī)體受到應(yīng)激原的刺激后產(chǎn)生的幾族高度保守的蛋白質(zhì)，對(duì)維持細(xì)胞生存和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用。其中熱休克蛋白70(HSP70)是最重要的一種HSP，它具有多種生物學(xué)功能，包括分子伴侶功能、參與免疫反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡功能、抗氧化功能、提高細(xì)胞的應(yīng)激耐受性、促進(jìn)細(xì)胞增殖、參與細(xì)胞骨架的形成和修復(fù)等等，其廣泛的生物學(xué)功能使之成為當(dāng)今生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)[1]。高熱是HSP的一種常見誘導(dǎo)方式，但是會(huì)引起機(jī)體的病理損傷，此外，一些化學(xué)性藥物也可以誘導(dǎo)HSP的表達(dá)，如重金屬、谷氨酰胺、中草藥和水楊酸鈉等[2-3]。谷氨酰胺(glutamine，Gln)具有副作用小、安全有效、價(jià)格便宜的特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種極有潛力的HSP誘導(dǎo)劑。Gln具有多種生物學(xué)作用，是一種條件性必需氨基酸，是體內(nèi)最豐富的氨基酸之一，能特異性地增強(qiáng)HSP70的表達(dá)，在畜牧業(yè)上可為開發(fā)新型、高效、安全的抗應(yīng)激飼料添加劑提供新思路。本文對(duì)HSP70的生物學(xué)功能、Gln對(duì)HSP70的誘導(dǎo)作用及機(jī)理、Gln在畜牧業(yè)中的應(yīng)用、Gln的應(yīng)用前景及注意事項(xiàng)等進(jìn)行了綜述，為Gln在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 熱休克蛋白70的生物學(xué)功能

1.1 分子伴侶功能

分子伴侶是指能夠結(jié)合和穩(wěn)定其它蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，并能促進(jìn)新生多肽的折疊、多聚體的裝配或降解及細(xì)胞器蛋白的跨膜運(yùn)輸?shù)囊活惖鞍踪|(zhì)。分子伴侶是HSP70最基本的生物學(xué)功能，它廣泛分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器中，參與所有細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和定位、蛋白質(zhì)的成熟、錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解及調(diào)節(jié)過程。HSP70作為一種重要的分子伴侶，可以參與識(shí)別和穩(wěn)定胞漿內(nèi)蛋白折疊裝配成天然狀態(tài)前的伸展多肽鏈；幫助分泌性蛋白與線粒體蛋白分別進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔或線粒體基質(zhì)，并在其進(jìn)入這些細(xì)胞器后折疊成天然構(gòu)象前穩(wěn)定其伸展?fàn)顟B(tài)；參與蛋白寡聚體的重排與蛋白質(zhì)凝聚物的解體和快速轉(zhuǎn)換的胞漿蛋白進(jìn)入溶酶體內(nèi)的降解；參與細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)吞作用；此外，類固醇激素受體復(fù)合物中存在HSP70，可能與該復(fù)合物的裝配有關(guān)[4]。

1.2 參與免疫反應(yīng)

HSP70參與免疫反應(yīng)是最先在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)的，腫瘤免疫也是當(dāng)前HSP70主要研究方向。1986年，Srivastava等[5]在小鼠腫瘤移植實(shí)驗(yàn)中獲得一系列排斥腫瘤的抗原，發(fā)現(xiàn)這些抗原屬于HSP，分別是HSP90、HSP70和HSP60，但從正常組織中提取的HSP不具有免疫活性；后來證實(shí)，所獲得的抗原并非單一的HSP，而是HSP和多肽的復(fù)合物。HSP70在免疫反應(yīng)中的主要作用是直接或間接加工提呈抗原，這也是HSP70能夠提高免疫效率的關(guān)鍵所在。抗原加工提呈受主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）限制，由此可分為MHCⅠ類途徑和MHCⅡ類途徑。HSP70不僅參與MHCⅠ類途徑和MHCⅡ類途徑，而且還具有類似MHCⅠ類分子結(jié)合抗原肽的結(jié)構(gòu)域，另外還可以作為抗原提呈分子直接將抗原肽提呈至細(xì)胞表面激發(fā)特異的γδT細(xì)胞反應(yīng)[6]。巨噬細(xì)胞（Mφ）在HSP70參與抗原提呈MHCⅠ類途徑中起著重要作用。Mφ中有HSP70的受體，HSP70多肽復(fù)合物與Mφ結(jié)合并被攝取，通過Mφ上的MHCⅠ類分子遞呈，最終激活以CD8+T細(xì)胞為主的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）；同時(shí)HSP70多肽復(fù)合物還能誘導(dǎo)Mφ分泌IL-1、IL-2、TNF-α和IFN等細(xì)胞因子。

1.3 抗細(xì)胞凋亡作用

細(xì)胞凋亡（apoptosis）或程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）是受基因調(diào)控的一種主動(dòng)性細(xì)胞自殺過程。它不僅是一種重要的生理現(xiàn)象，也是一種重要的病理現(xiàn)象，是與許多疾病緊密相聯(lián)的。研究表明，HSP70的表達(dá)對(duì)各種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抑制作用[7]。HSP70抗細(xì)胞凋亡作用機(jī)制可能主要與HSP70抑制應(yīng)激活化蛋白激酶（stress activated protein kinases，SAPK；c-junN-terminal kinases，JNK）活性有關(guān)，同時(shí)與抑制半胱氨酸蛋白酶（caspase）活性和抑制促凋亡基因的表達(dá)也有密切關(guān)系。譚紅梅等[8]在HSP70調(diào)節(jié)JNK活性與細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡對(duì)JNK的依賴性與HSP70的抗細(xì)胞凋亡作用有明顯的相關(guān)性，細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)可以通過阻斷信號(hào)通路，抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的JNK激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。Mosser等[9]在研究HSP70對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的HSP70能抑制caspases-3的活性，認(rèn)為這可能是HSP70抗細(xì)胞凋亡作用的主要機(jī)制。Gordon等[10]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HSP70表達(dá)能抑制P53和P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并抑制另一種促細(xì)胞凋亡基因——Bax的表達(dá)。

1.4 抗氧化作用

HSP70通過減少應(yīng)激時(shí)氧自由基的產(chǎn)生而提高應(yīng)激細(xì)胞的抗氧化作用，一方面可以通過抑制產(chǎn)生氧自由基的關(guān)鍵酶（NADPH氧化酶），減少氧自由基的產(chǎn)生；另一方面可以通過直接釋放和增加內(nèi)源性過氧化酶，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），而經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)除去氧自由基。Das等[11]發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注引起了數(shù)種應(yīng)激相關(guān)的抗氧化基因的激活，包括HSP70 Mn-SOD基因。Niedzwiecki等[12]在37℃果蠅中發(fā)現(xiàn)，SOD-mRNA水平的增高與HSP70 mRNA表達(dá)的增高相一致。

1.5 抗應(yīng)激作用

應(yīng)激作用后，機(jī)體中HSP70的分布和表達(dá)發(fā)生顯著變化，這是HSP70發(fā)揮抗應(yīng)激作用的重要體現(xiàn)。Angelidis等[13]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)HSP70數(shù)量增加，細(xì)胞抗熱性亦增加；細(xì)胞內(nèi)HSP70數(shù)量減少，細(xì)胞抗熱性降低。王楓等[14]在HSP70高表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞熱耐力的影響研究中發(fā)現(xiàn)，HSP70水平高的細(xì)胞其熱耐力明顯高于HSP70水平低的細(xì)胞，HSP70水平與細(xì)胞的熱耐力呈正相關(guān)。HSP70可以穩(wěn)定應(yīng)激時(shí)胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和預(yù)防胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，還可以遷徙到核仁中，與部分組裝的核糖體建立聯(lián)系，從而保護(hù)細(xì)胞核蛋白；應(yīng)激細(xì)胞內(nèi)HSP70水平的增高可以阻斷細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，抑制應(yīng)激活化蛋白激酶的活化，從而抵抗細(xì)胞凋亡；HSP70在細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化的生物學(xué)活性，可以保護(hù)應(yīng)激細(xì)胞抵抗過氧化物的損害；HSP70具有免疫調(diào)節(jié)作用，有人稱其為“伴侶因子”，它在抗應(yīng)激免疫損傷方面發(fā)揮著一定作用；在應(yīng)激過程中，HSP70還參與細(xì)胞骨架的形成與修復(fù)。

1.6 其它生物學(xué)功能

除了以上生物學(xué)功能之外，HSP70還具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，參與細(xì)胞骨架的形成和修復(fù)等功能[4]。

2 谷氨酰胺對(duì)熱休克蛋白70的誘導(dǎo)作用及機(jī)理

2.1 谷氨酰胺對(duì)熱休克蛋白70的誘導(dǎo)作用

大量的研究結(jié)果表明，Gln能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生HSP，且能特異性地增強(qiáng)起主要保護(hù)作用的HSP70的表達(dá)。Sanders等[15]在研究Gln對(duì)果蠅Kc細(xì)胞的HSP表達(dá)的體外影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，向熱處理的Kc細(xì)胞培養(yǎng)液里加入Gln，其添加量越高HSP表達(dá)水平越高，他認(rèn)為Gln對(duì)HSP的表達(dá)起重要作用。Wischmeyer等[16]以鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，通過靜脈灌注方式供給Gln，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)Gln灌注劑量為0.15～0.75 g/kg時(shí)，在鼠體內(nèi)的多處器官，如心、肺、結(jié)腸等，HSP70的表達(dá)增加。吳瓊等[17]在Gln對(duì)大鼠HSP70表達(dá)的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，靜脈注射可在大鼠心、肝、肺和主動(dòng)脈中誘導(dǎo)HSP70 mRNA的表達(dá)，且存在劑量依賴性關(guān)系，其起始劑量0.15 g/kg即可引起各臟器的HSP70表達(dá)。0.75 g/kg Gln注射后1 h、6 h和12 h均獲得了HSP70的表達(dá)，并明顯高于24 h和48 h，說明Gln注射后1～12 h是誘導(dǎo)HSP70 mRNA表達(dá)的高峰期，期望這能為臨床用藥時(shí)機(jī)提供參考。張志宏等[18]在谷氨酰胺對(duì)小白鼠HSP70誘導(dǎo)表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射Gln，4 h后檢測(cè)mRNA和蛋白水平，小鼠肝臟、子宮和卵巢組織細(xì)胞的HSP70均已誘導(dǎo)表達(dá)，且HSP70表達(dá)量隨著Gln劑量的加大而增加；0.45 g/kg時(shí)HSP70表達(dá)量顯著提高。

2.2 谷氨酰胺對(duì)熱休克蛋白70的誘導(dǎo)機(jī)理

HSP70的表達(dá)調(diào)控表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平，且主要是在轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控與熱休克因子和熱休克元件相關(guān)。無應(yīng)激狀態(tài)下，熱休克因子以無活性的單體形式存在；當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，熱休克因子由單體向三聚體轉(zhuǎn)換，每3個(gè)熱休克因子單體結(jié)合在一起形成一個(gè)三聚體。在多種熱休克蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)都有1個(gè)或數(shù)個(gè)高度保守的DNA序列，其作用是與熱休克因子進(jìn)行特異性結(jié)合，激活熱休克蛋白基因的轉(zhuǎn)錄活化，這種高度保守的DNA序列稱之為熱休克元件。在應(yīng)激條件下，熱休克因子三聚體與熱休克元件結(jié)合，加快了RNA聚合酶從暫停點(diǎn)上的逸脫速度(100倍以上)，使其具有了連續(xù)轉(zhuǎn)錄延伸的活性，從而上調(diào)基因表達(dá)的水平[19]。許多研究表明，Gln對(duì)HSP70的誘導(dǎo)主要通過改變熱休克因子的活性而發(fā)揮作用。Peng等[20]通過基因敲除的方法研究Gln對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱休克因子被敲除的細(xì)胞在添加Gln后，不能減輕熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。Angela等[21]通過試驗(yàn)也證明Gln增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)應(yīng)激損傷的抵抗力是通過熱休克因子起作用的。

3 谷氨酰胺在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

3.1 谷氨酰胺作為抗應(yīng)激添加劑

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，添加Gln有助于增強(qiáng)機(jī)體對(duì)應(yīng)激的抵抗力，Gln被認(rèn)為是一種極有發(fā)展前景的動(dòng)物抗應(yīng)激添加劑。

3.1.1 增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力

應(yīng)激可導(dǎo)致大量自由基的產(chǎn)生和釋放，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，還可以限制谷胱甘肽的合成，引起機(jī)體抗氧化能力下降，導(dǎo)致多個(gè)器官功能的損害。Gln是細(xì)胞合成谷胱甘肽的前體物質(zhì)，可通過保持和增加組織細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的儲(chǔ)備，有利于保護(hù)或減輕內(nèi)皮細(xì)胞免受氧自由基介導(dǎo)的損傷，穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，也有利于受損細(xì)胞的修復(fù)和功能恢復(fù)，提高機(jī)體抗氧化能力[22]。

3.1.2 提高機(jī)體免疫力

機(jī)體發(fā)生應(yīng)激時(shí)，免疫器官及其功能會(huì)受到損傷。Gln具有免疫調(diào)節(jié)作用，它是淋巴細(xì)胞分泌、增殖及其功能維持所必需的。作為核酸生物合成的前體和主要能源，Gln可促使淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的有絲分裂和分化增殖，增加細(xì)胞腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素1等的產(chǎn)生[23]。此外，Gln具有維持腸道免疫功能的作用，促進(jìn)腸道黏膜產(chǎn)生更多分泌型免疫球蛋白，阻止細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位，增加機(jī)體的免疫能力。

3.1.3 補(bǔ)充機(jī)體需要的營養(yǎng)和能量

機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)對(duì)于營養(yǎng)物質(zhì)的需求增加，需要產(chǎn)生更多的能量供給機(jī)體。Gln具有重要的營養(yǎng)作用，是合成嘌呤、嘧啶、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、谷胱甘肽和許多其它生物分子的前體物質(zhì)，是機(jī)體內(nèi)各器官之間轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸和氮的主要載體，也是快速生長(zhǎng)和分化細(xì)胞的主要燃料[24]。另外，Gln還是腸道的主要能量來源，谷氨酰胺大約有2/3的碳被氧化成二氧化碳，約占腸道總量的40%。Gln也是一種大腦燃料，它是少數(shù)幾種能克服血腦屏障和參與化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)之一，在大腦中被轉(zhuǎn)化為谷氨酸與葡萄糖一起參與腦代謝。

3.1.4 調(diào)節(jié)機(jī)體酸堿平衡

在應(yīng)激狀態(tài)下，動(dòng)物機(jī)體需要更多的能量，無氧酵解增加，產(chǎn)生過多的乳酸，在不同程度上引起代謝性酸中毒。Gln是腎產(chǎn)氨最重要的前體，對(duì)機(jī)體內(nèi)酸堿平衡的調(diào)節(jié)起著十分重要的作用[24]。Gln抗酸作用的機(jī)理是：谷氨酰胺從肌肉、肝、肺等器官釋放出來被腎遠(yuǎn)端小管還原成氨和谷氨酸，氨結(jié)合氫離子成氨離子，與陰離子如氯離子一起排出體外。

3.1.5 誘導(dǎo)熱休克蛋白70表達(dá)間接發(fā)揮作用

作為一種非特異性的細(xì)胞保護(hù)蛋白，HSP70在應(yīng)激條件下參與細(xì)胞的抗損傷、修復(fù)和熱耐受過程，保護(hù)細(xì)胞生命活動(dòng)。Gln通過對(duì)HSP70的誘導(dǎo)表達(dá)，使其在穩(wěn)定細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、抗應(yīng)激細(xì)胞凋亡、抵抗過氧化物的損害和抗應(yīng)激免疫損傷等方面發(fā)揮著重要作用。雖然HSP70對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，但是這種保護(hù)作用不是無限的，而是只能在一定范圍內(nèi)起作用，如應(yīng)激時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

3.2 谷氨酰胺作為營養(yǎng)添加劑

Gln作為體內(nèi)最豐富的氨基酸之一，具有重要的營養(yǎng)功能，在改善機(jī)體代謝、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、改善機(jī)體免疫狀況、能量供給和增長(zhǎng)肌肉等方面發(fā)揮著重要作用，因此有人稱之為“免疫營養(yǎng)素”。

董金格等[25]在外源添加Gln對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能和胴體組成的影響研究中發(fā)現(xiàn)，外源添加Gln具有提高肉仔雞日增重和降低料重比、提高胸肌率和腿肌率、降低脂肪含量以及改善肉仔雞胴體組成的趨勢(shì)，其中0.5%的添加量效果最佳。黃冠慶等[26]在研究中發(fā)現(xiàn)，在肉仔雞飼料中添加適宜的Gln，有利于提高肉仔雞的體重、日增重、飼料報(bào)酬和成活率，添加量為0.8%時(shí)效果最好，且Gln添加量為0.8%時(shí)可明顯提高21日齡時(shí)法氏囊、脾臟、肝臟和胰腺的重量以及法氏囊指數(shù)。李紅等[27]報(bào)道，在斷奶仔犬日糧中添加2%Gln后，其平均日采食量比對(duì)照組提高18.8%，平均日增重提高48.9%，說明Gln能明顯地改善斷奶仔犬的生長(zhǎng)性能。

4 谷氨酰胺應(yīng)用前景及注意事項(xiàng)

4.1 谷氨酰胺應(yīng)用前景

在現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中，畜禽正面臨越來越多的應(yīng)激，結(jié)果導(dǎo)致其采食量下降、生長(zhǎng)速度緩慢，甚至引起死亡，給畜牧業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。為了減緩應(yīng)激帶來的不良后果，除了通過物理措施改善動(dòng)物的外界生長(zhǎng)環(huán)境外，還可通過添加抗應(yīng)激添加劑，如維生素制劑和微量元素，但是單一作用的抗熱應(yīng)激添加劑的作用是有限的，具有復(fù)合作用的單一添加劑或幾種添加劑組成的復(fù)合添加劑的使用效果更好。HSP70具有廣泛的生物學(xué)功能和細(xì)胞保護(hù)作用，利用HSP70誘導(dǎo)劑作為抗應(yīng)激的添加劑在臨床上具有重要意義。Gln被認(rèn)為是一種極有潛力的熱休克蛋白誘導(dǎo)劑，它可以顯著地提高動(dòng)物機(jī)體HSP70的表達(dá)，還可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、激活免疫和調(diào)節(jié)酸堿平衡等。Gln作為飼料添加劑使用時(shí)，是一種極有發(fā)展前景的新型抗應(yīng)激藥物和動(dòng)物營養(yǎng)性飼料添加劑，在臨床上具有極大的推廣價(jià)值。

4.2 注意事項(xiàng)

Gln制劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床，主要是通過口服和靜脈注射來用藥的。但應(yīng)注意以下事項(xiàng)：Gln為氨基酸類藥物，若服用劑量過大或長(zhǎng)期服用會(huì)對(duì)腎臟造成一定的損害；Gln能增加腸道對(duì)鈉和水的吸收，長(zhǎng)期服用有可能造成便秘；對(duì)有嚴(yán)重的肝功能損傷的病人禁用Gln，因血氨增加可誘發(fā)肝性腦病甚至肝昏迷；Gln在高溫下不穩(wěn)定，會(huì)被分解破壞，忌與加熱的食物混合攝入；Gln對(duì)酸敏感，忌與含酸量高的食物或酸性的藥物混合使用。畜牧業(yè)中，作為營養(yǎng)添加劑使用時(shí)，可以添加到飼料中，一般劑量為0.5%～1%；作為抗應(yīng)激添加劑使用時(shí)，可以添加到飲水中，但應(yīng)注意Gln水中溶解度和穩(wěn)定性，宜現(xiàn)配現(xiàn)用。除了Gln之外，新的Gln供體已經(jīng)出現(xiàn)，如人工合成的谷氨酰胺雙肽，包括甘氨酸-谷氨酰胺和丙氨酸-谷氨酰胺。它們具有穩(wěn)定性好、水溶性強(qiáng)、能耐受熱等優(yōu)點(diǎn)，在體內(nèi)迅速水解轉(zhuǎn)化為Gln，具有Gln應(yīng)用的全部理化特性，在臨床上具有更廣闊的應(yīng)用前景。

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