纖維素酶和乳酸菌混合制備槐樹葉青貯飼料的工藝

王巍杰 尹丹 王麗萍

隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，自然資源日漸短缺，人畜爭糧矛盾更加嚴(yán)重，亟待開發(fā)新的飼料資源。植物樹葉含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和多種礦質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)[1]，能夠滿足動物日常養(yǎng)分的需要。但由于樹葉中纖維素含量高，嚴(yán)重影響動物的消化率和適口性，文中以槐樹葉為原料，研究纖維素酶和乳酸菌混合制備青貯飼料的工藝過程。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

粉碎烘干的新鮮槐樹葉；復(fù)合乳酸菌制劑（乳酸菌、雙歧桿菌、糞腸球菌）由廈門六維生物制劑公司提供；纖維素酶（活性800 U/ml）由河南鄭州雅大生物工程股份有限公司提供；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、3，5-二硝基水楊酸、葡萄糖均為分析純。

HS-3C型酸度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn)）；DKB-501A型超級恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)）；752型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)）；FA1004型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 槐樹葉青貯飼料的制備

準(zhǔn)確稱取100.00 g的槐樹葉于廣口玻璃瓶中，加入適宜比例的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)整適當(dāng)?shù)暮浚邏簻缇砑舆m量纖維素酶，恒溫水浴一段時(shí)間后，測還原糖，計(jì)算糖化率；再混合適量乳酸菌，在適當(dāng)溫度下發(fā)酵一定時(shí)間,60℃干燥后，即得槐樹葉青貯飼料。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 糖化率[2]

糖化率（%）=（還原糖×0.9/槐樹葉中纖維素含量）×100。

還原糖含量[3]用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.527 7x-0.049 7（r=0.999 8，n＝6，由752型紫外-可見分光光度計(jì)繪制）計(jì)算。

1.2.2.2 pH值[4]

取槐樹葉青貯飼料樣品10.00 g于燒杯中，加入100 ml蒸餾水，均勻攪拌，4℃靜置24 h，用酸度計(jì)測定青貯飼料浸出液pH值。

1.2.2.3 營養(yǎng)成分含量

粗蛋白含量的測定采用凱式定氮法[3]并且參照GB/T6432—94[5]；粗纖維含量的測定采用酸性洗滌劑法[3]；水溶性碳水化合物（wsc）含量的測定采用硫酸—蒽茼比色法[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響纖維素酶降解槐樹葉的因素

2.1.1 pH值對纖維素酶降解的影響(見圖1)

圖1 pH值對纖維素酶降解的影響

按1.2.1操作，分別考察在pH值3.6、4.0、4.4、5.0和5.6的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入相同的纖維素酶恒溫水浴后糖化率的變化，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：在pH值3.6～4.4的范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，還原糖的糖化率逐漸升高，當(dāng)pH值大于4.4時(shí)，糖化率隨著pH值的增加逐漸減小，初步確定正交實(shí)驗(yàn)的pH值4.4、4.6和5.0。

2.1.2 溫度對纖維素酶降解的影響(見圖2)

圖2 溫度對纖維素酶降解的影響

按1.2.1操作，在pH值為4.4的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液中加入相同的纖維素酶，在溫度35、40、45、50和55℃條件下，恒溫水浴相同時(shí)間后，分別測定還原糖的糖化率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示：在溫度35～50℃范圍內(nèi)，還原糖的糖化率隨溫度的升高而增大，溫度大于50℃時(shí)，糖化率呈現(xiàn)下降趨勢，綜合考慮纖維素酶的最適反應(yīng)溫度，確定正交實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)溫度為45、50和55℃。

2.1.3 酶解時(shí)間對纖維素酶降解的影響(見圖3)

圖3 酶解時(shí)間對纖維素酶降解的影響

按1.2.1操作，在pH值為4.4的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液中加入相同的纖維素酶，在水浴溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間12、16、20、24、28、32、36、40、44和48 h條件下測定糖化率的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨酶解時(shí)間的增加，糖化率呈逐漸上升趨勢，但隨時(shí)間的延長，糖化率增長速度緩慢，可能由于在酶解過程中產(chǎn)生了對纖維素酶有抑制作用的產(chǎn)物，減慢了酶水解的速率[6]。因此，確定正交實(shí)驗(yàn)的酶解時(shí)間為40、44、48 h。

2.2 纖維素酶降解槐樹葉最佳工藝條件的確定

以還原糖的糖化率為考察指標(biāo)，按1.2.1纖維素酶降解槐樹葉操作，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，考察pH值、溫度、加酶量（由單因素水平實(shí)驗(yàn)確定的纖維素酶占槐樹葉的質(zhì)量比）和酶解時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 纖維素酶酶解正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平

表2 纖維素酶降解槐樹葉的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：pH值、溫度、加酶量和時(shí)間對酶解糖化率的影響順序?yàn)锽＞A＞D＞C,最佳組合為A1B2C1D3，確定纖維素酶降解槐樹葉最佳工藝條件：pH值4.4、溫度50℃、加酶量0.75%和酶解時(shí)間為48 h。

2.3 乳酸菌發(fā)酵最佳工藝條件的確定

以2.2確定的纖維素酶解的最佳工藝條件按1.2.1進(jìn)行操作，用加入檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液的量控制槐樹葉含水量，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，以制得的槐樹葉青貯飼料粗蛋白為指標(biāo)，考察含水量、溫度、乳酸菌添加量（槐樹葉質(zhì)量比）對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，因素水平見表3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：含水量、溫度和乳酸菌添加量對乳酸菌發(fā)酵槐樹葉的影響主次順序?yàn)锳＞B＞D,最佳組合為A2B1D2，確定乳酸菌發(fā)酵的最佳工藝條件為含水量70%、溫度35℃和乳酸菌添加量為1.5%。

表3 乳酸菌發(fā)酵槐樹葉正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平

表4 乳酸菌發(fā)酵槐樹葉的正交實(shí)驗(yàn)

2.4 槐樹葉青貯飼料營養(yǎng)指標(biāo)

在最佳工藝條件下制備槐樹葉青貯飼料，感官評定[4]：顏色呈深綠色，無霉變，有草香味。測得粗蛋白含量23.54%、粗纖維含量9.18%、碳水化合物含量為3.31%,pH值為4.57。

3 結(jié)論

在樹葉飼料制備過程中添加纖維素酶可降低纖維素含量，還能促進(jìn)可溶性糖的轉(zhuǎn)化，有利于乳酸菌發(fā)酵，改善飼料口味。通過正交實(shí)驗(yàn)分別確定了纖維素酶酶解和乳酸菌發(fā)酵制備槐樹葉青貯飼料的工藝條件：在pH值4.4、溫度50℃、加酶量0.75%和酶解時(shí)間48 h條件下纖維素酶酶解效果最好；乳酸菌發(fā)酵槐樹葉制備青貯飼料的條件為含水量70%、溫度35℃和乳酸菌添加量1.5%。

[1] 趙林,李國軍，唐瑩，等.利用銀杏葉制備酵母飼料添加劑的優(yōu)良菌篩選及其培養(yǎng)條件[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2007,27（3）：37.

[2] 劉小杰,郭秀峰,歐凱.利用纖維素酶降解稻草粉[J].中國食品添加劑，2009（4）：99-102.

[3] 常麗新,田秀紅,閆峰,等.食品分析技術(shù)[M].北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社,2004.

[4] 王鵬,劉丹麗,高仲元,等.含水量和乳酸菌制劑對狗尾草發(fā)酵品質(zhì)的影響[J].草地學(xué)報(bào)，2006，14（3）：269-273.

[5] 馬東霞.GB/T 6432-94—1994飼料中粗蛋白測定方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995:70-73.

[6] 崔立,劉忠.酶水解纖維素條件的優(yōu)化[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010（2）：41-44.