三種中藥復方制劑對雞MD的影響及其機制的研究

漢麗梅 王曉峰 孫娜 張金路 谷永生 孔延飛

在飼料中廣泛添加抗生素、激素等藥物防病治病及提高生產性能[1]，在為現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖帶來可觀的經濟效益的同時，卻對產品的質量產生了影響，增加了畜產品中藥物殘留的風險，可能會危害人類的健康。許多研究都發(fā)現(xiàn)中草藥具有無殘留、無抗藥性、無毒副作用、無污染并能顯著提高動物的生產性能、提高動物的抗病能力的特點[2-7]，使科技工作者越來越關注中草藥在動物生產中的應用研究。

雞馬立克氏病（Marek's Disease,MD）是由馬立克病毒(Marek's Disease virus,MDV)引起的一種淋巴組織增生性疾病[8],是很好的動物病毒型腫瘤的研究模型。應用人類廣泛應用的具有抗病毒作用的三種中藥復方:復方制劑1[9]、復方制劑2[10]、復方制劑3[11]，并對配方進行調整，進行了抗MDV感染的作用效果及其可能機理的研究與探討，為開發(fā)在畜牧生產中具有應用前景的無藥物殘留的中藥抗病毒制劑，提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1日齡雞雛（無基礎免疫）由沈陽農業(yè)大學實驗雞場提供。MDV京-1株血毒由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈。

1.2 方法

1.2.1 MD模型的建立

1日齡雛雞腹腔接種MD病毒0.22 ml/只，建立MD動物模型。空白對照組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.2 中藥復方添加劑的加工與處理

中藥復方1主要以免疫促進作用、抗應激作用、抗氧化作用的山茱萸、茯苓等成分為主；中藥復方2主要以白芍、川芎等保肝養(yǎng)血成分為主；中藥復方3主要以黃連、黃柏等抗炎抑菌的成分為主。三種中藥復方按照藥方進行配制，并研磨成粉，藥粉經80目網篩篩選后，按0.5%添加量將復方制劑添加于飼料中。

1.2.3 試驗分組與給藥方式及樣品收集

180只1日齡雛雞隨機分空白對照組、攻毒對照組、攻毒試驗組(復方1組、復方2組、復方3組)。采用拌料給藥的方式，按設計的比例將復方制劑添加于飼料中。攻毒后，試驗組立即給藥，給藥期為14 d。給藥期結束后，在停藥后0、14、28 d進行采樣。

1.2.4 血清生化指標的檢測與分析

血清總超氧化物歧化酶（SOD）的測定采用黃嘌呤氧化酶法測定，結果計算以每毫升反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個亞硝酸鹽單位（NU）[12]；血清丙二醛（MDA）的測定采用過氧化脂質降解產物中的MDA可以與硫代巴比妥（TBA）縮合，形成紅色產物，此產物在532 nm處有最大吸收峰。端粒酶活性測定采用改進的Trap法進行端粒酶活性的測定[13]。應用模版序列(R5:TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG)為陽性對照，PCR引物序列（P1：5’-TCACC TTGTA ATCCG ATCCG TCGAGCAGAGTT-3’；P2：5’-CAACA TCTCC ACTAC CTTCT AACCG TAACC-3’），銀染法鑒定，Bandscan軟件處理圖像，進行活性分析。采用MTT法測定T淋巴細胞轉化率；免疫器官指數(shù)比的計算：脾臟、胸腺、法氏囊重量之和與雞活體重的比。玫瑰花環(huán)試驗方法采用淋巴細胞懸液0.02 ml，加入1%紅細胞懸液0.02 ml輕震混合，37℃溫箱或水浴保溫5 min，低速離心（500 r/min）5 min，在4℃放置1～2 h，推片，自然干燥，美蘭染色后分析。

2 結果與分析

2.1 給藥結束后第0 d各指標的動態(tài)變化

給藥結束后第0 d，復方制劑1組SOD活性顯著高于對照組和其它各組（P＜0.05），MDA含量顯著低于對照組和其它各組（P＜0.05），玫瑰花換率顯著高于空白及攻毒對照組（P＜0.05）；復方制劑1、2組端粒酶活性均顯著低于攻毒對照組（P＜0.05），復方制劑3組端粒酶活性顯著高于其它各組；三種不同復方制劑組的免疫器官指數(shù)比均顯著低于攻毒對照組、空白對照組（P＜0.05）；玫瑰花環(huán)率變化不明顯，淋巴細胞轉化率值均高于空白對照組，但無統(tǒng)計學意義。

綜合分析表明，給藥結束后第0 d，復方制劑1飼料添加飼喂MDV感染雞，能增強機體的抗氧化能力和提高機體的免疫機能，在一定程度上降低MDV對機體的損傷程度（見圖1、圖2）。

圖1 給藥結束后第0 d組間各指標比較結果

圖2 給藥結束后第14 d組間各指標比較結果

2.2 給藥結束后第14 d各指標的動態(tài)變化

給藥結束后第14 d，各復方制劑組SOD活性顯著低于攻毒對照組和空白對照組（P＜0.05），復方制劑1組的SOD活性顯著高于其它兩種復方制劑組（P＜0.05）；MDA含量顯著低于其它兩種復方制劑組；復方制劑2、3組MDA含量顯著高于攻毒對照組（P＜0.05），復方制劑1、2組端粒酶活性顯著低于攻毒對照組（P＜0.05）；三種不同復方制劑組的免疫器官指數(shù)比均低于攻毒對照組、空白對照組；三種不同復方制劑組T淋巴細胞轉化率值均高于空白對照組；復方制劑1、2組T淋巴細胞轉化率值低于攻毒對照組，但無統(tǒng)計學意義。

綜合分析表明，給藥結束后第14 d，復方制劑1飼料添加飼喂MDV感染雞，在停藥14 d后，腫瘤標志物端粒酶的活性顯著降低，但是SOD活性與空白對照組相比，也同時降低，MDA含量也有所降低，免疫功能無明顯改善，說明藥效維持可能具有一定的時效性（見圖1、圖2）。

2.3 給藥結束后第28 d各指標的動態(tài)變化

給藥結束后第28 d，三種不同復方制劑組SOD活性顯著低于攻毒對照組和空白對照組（P＜0.05），復方制劑1組的SOD活性顯著高于其它兩種復方制劑組（P＜0.05）；三種不同復方制劑組MDA含量顯著高于攻毒對照組和空白對照組（P＜0.05），復方制劑1、2組端粒酶活性顯著低于攻毒對照組（P＜0.05），高于空白對照組，復方制劑3組端粒酶活性顯著高于攻毒對照組（P＜0.05）。三種不同復方制劑組的免疫器官指數(shù)比均顯著低于攻毒對照組、空白對照組（P＜0.05）；復方制劑1組T淋巴細胞轉化率值高于攻毒對照組、空白對照組及復方制劑2、3組，但無統(tǒng)計學意義（見圖1、圖2）。

綜合分析表明，復方制劑1在給藥期間，在一定程度上能提高機體的抗氧化能力、提高機體免疫力和降低腫瘤標志物端粒酶的活性，在抗腫瘤生成和抗病毒感染方面起一定的作用，但藥效的維持有一定的時效性。

3 討論

利用我國的醫(yī)藥國寶“中草藥”進行抗腫瘤和抗病毒的研究已經進入了一個成熟階段[14-17]，對其機理的研究也成為了熱點。王三龍[18]等認為中草藥在抗癌、防癌的方面有著巨大的潛能和美好的前景。厲將斌[19]等對復方921粗提物的研究中，發(fā)現(xiàn)其對腫瘤細胞的DNA合成有抑制作用，能誘導s期相關蛋白CycIinA表達下調。

機體的免疫系統(tǒng)具有限制腫瘤細胞生長的能力[20]。免疫系統(tǒng)能識別和殺死惡性腫瘤細胞，若免疫防護能力差或對不正常細胞識別能力差，會導致癌癥發(fā)生率的升高，因此免疫刺激劑和免疫調節(jié)劑被認為是潛在的抗癌劑[20]。因此具有抗癌、提高機體免疫力功能的中藥及其復方制劑成為新的研究熱點。

永生性的獲得是惡性腫瘤細胞的一個顯著生物學特性，也是腫瘤組織具有無限增殖能力的基礎，而腫瘤細胞無限增殖能力的維持則依賴于端粒酶的激活[21]。本研究在MDV感染雞不同時期，對血液和組織樣本進行了血液生化指標、病理學變化、免疫指標、機體抗氧化能力、端粒酶活性等的檢測分析。通過分析發(fā)現(xiàn)三種復方都能在一定程度上增強機體抗氧化能力以及清除體內自由基的能力，降低細胞的損傷，提高免疫系統(tǒng)機能，同時抑制端粒酶活性，達到抑制細胞的永生化和抗腫瘤和抗病毒效果，但飼喂時間和效果之間的關系的研究，還有待深入。

利用中草藥添加劑抗病毒，其藥物處理簡單，成本低，無藥物殘留，降低對人體的間接危害，在畜牧生產中具有良好的應用前景，但根據驗方開發(fā)中藥添加劑，對其有效的針對性應用以及使用方式還有待深入探討。

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