基于逆轉錄病毒載體的外源基因表達系統的評價和應用

葉玲玲，許建，李世崇，劉紅，劉興茂，王啟偉，陳昭烈

1 軍事醫學科學院生物工程研究所，北京 100071

2 中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所，北京 100021

生物技術藥物是 21世紀生物技術領域中引人關注的研究和產業熱點。目前，采用哺乳動物細胞表達系統生產重組蛋白藥物已經成為生物制藥產業的主流，其市場份額已超過全球生物技術藥物銷售額的 2/3[1-2]。在以哺乳動物細胞為生產系統的重組蛋白藥物的生產中，獲得高效、穩定表達外源目的蛋白的細胞系是其中至關重要的環節[3-4]。

逆轉錄病毒表達系統通常由包膜蛋白載體、逆轉錄病毒載體和包裝細胞系組成。逆轉錄病毒載體攜帶的外源目的基因整合到宿主細胞時，具有傾向發生于染色體開放區和轉錄活躍位點的明顯特點[5-6]。這一基因整合特性能有效地將外源目的基因整合入靶細胞基因組并使之穩定高效地表達。同時，由于逆轉錄病毒可以與多種細胞表面蛋白結合而進入細胞，其宿主細胞范圍很廣，具有感染終末分化細胞的能力，使其成為基因治療研究、RNA干擾和基因功能研究中廣泛采用的基因轉移載體[7-9]。

2005年，Bleck采用逆轉錄病毒表達系統構建了抗體表達水平達到1.6 g/L的CHO細胞系[10]。這一結果提示逆轉錄病毒表達系統有望成為構建高效、穩定表達外源蛋白的工程細胞系的新的技術途徑。基于此，本研究以增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP) 基因的表達水平和穩定性為指標，考察逆轉錄病毒表達載體pQCXIN介導的外源基因在HEK293細胞和CHO-K1細胞的表達效率，并采用 pQCXIN載體構建了高效表達人重組活性蛋白 C (Recombinant human activated protein C，rhAPC) 的HEK293細胞系。

1 材料與方法

1.1 細胞和質粒

HEK293細胞和質粒 pcDNA3.1(+)、大腸桿菌DH5α均購自美國Invitrogen公司；CHO-K1細胞購自美國ATCC；逆轉錄病毒表達載體pQCXIN、包膜蛋白載體pVSV-G和病毒包裝細胞GP2-293均購自美國 Clontech公司；質粒 pcDNA3.1/EGFP和pcDNA3.1/rhPC由本實驗室構建。

1.2 試劑和培養基

限制性內切酶及DNA連接酶購自美國NEB公司；DNA Marker、質粒提取試劑盒和DNA純化回收試劑盒購自美國 Qiagen公司；轉染試劑LipofectamineTM2000購自美國 Invitrogen公司；G418購自德國Merck公司；DMEM/F12培養基和胎牛血清購自美國HyClone公司；蛋白C標準品和蛋白C兔多克隆抗體購自美國Sigma公司；HRP標記山羊抗兔IgG購自上海萊博生物公司。

1.3 攜帶外源基因的pQCXIN逆轉錄病毒表達載體的構建

EGFP cDNA和 rhAPC cDNA分別從質粒pcDNA3.1/EGFP和 pcDNA3.1/rhPC中經 AgeⅠ/ PacⅠ雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳分離、膠回收純化，雙粘端連入逆轉錄病毒表達載體 pQCXIN，構建攜帶EGFP基因的逆轉錄病毒表達載體pQCXIN/EGFP和攜帶 rhAPC基因的逆轉錄病毒表達載體pQCXIN/rhAPC。

1.4 攜帶外源基因的重組逆轉錄病毒的制備和滴定

GP2-293細胞在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，37 ℃、5% CO2貼壁生長于75 cm2培養瓶中，當細胞的匯合度達到 90%時，分別用pQCXIN/EGFP和 pVSV-G、pQCXIN/rhPC 和pVSV-G進行雙質粒共轉染。二質粒摩爾比為1∶1，總量20 μg，轉染后5 h后更換新鮮的含10%胎牛血清DMEM/F12培養基，48 h后收獲細胞培養上清。細胞培養上清經0.45 μm濾膜濾器過濾除去細胞碎片后，50 000×g、4 ℃超速離心1.5 h，倒掉上清，按100倍濃縮加入含10%胎牛血清DMEM/F12培養基懸浮沉淀，?70 ℃超低溫冷柜保存。病毒滴定參照文獻進行，并將病毒滴度定義為 GTU/mL (Gene transfer unit per ml)[11]。濃縮后的病毒滴度為1×107~2×107GTU/mL。

1.5 HEK293細胞和CHO-K1細胞的轉染及篩選

1.5.1 陽離子脂質體介導的細胞轉染

參照 LipofectamineTM2000說明書，轉染前1天分別將HEK293細胞和CHO-K1細胞以7.5×105細胞/孔接種6孔板，37 ℃，5% CO2培養至細胞形成 80%~90%的匯合細胞層，轉染前更換不含血清的 DMEM/F12培養基。取 10 μg質粒pcDNA3.1/EGFP或 pcDNA3.1/rhPC用不含血清的DMEM/F12培養基稀釋至 250 μL；用無血清DMEM/F12培養基稀釋10 μL LipofectamineTM2000至250 μL。將上述兩種液體移入同一EP管中混勻，室溫避光放置20 min后分別加入對應的6孔板中搖勻，37 ℃、5% CO2培養6 h后補加含10%胎牛血清DMEM/F12培養基繼續培養24 h。

1.5.2 重組逆轉錄病毒的細胞感染

重組逆轉錄病毒感染前1天分別將HEK293細胞和CHO-K1細胞以7.5×105細胞/孔接種6孔板，37 ℃、5% CO2培養至細胞形成80%~90%的匯合細胞層，感染前更換含1%胎牛血清的DMEM/F12培養基。取200 μL逆轉錄病毒pQCXIN/EGFP或 pQCXIN/rhAPC分別加入對應的6孔板中搖勻，37 ℃、5% CO2培養 6 h后更換含 10%胎牛血清DMEM/F12培養基繼續培養24 h。

1.5.3 轉染陽性細胞的篩選和單克隆化

轉染24 h后，用0.25% (W/V) 胰蛋白酶消化HEK293細胞并將各孔細胞分別接種至 24孔板，4~5 h細胞貼壁后，培養基換為含0.6 g/L G418和10%胎牛血清的DMEM/F12培養基。3~4 d換液1次。直到2周后陽性克隆長出。胰酶消化，擴大培養，用于外源基因表達強度分析；或采用有限稀釋法將細胞接種于 96孔板克隆生長、篩選 rhAPC高效表達HEK293細胞系。

1.6 測定和分析方法

采用 Cedex AS20細胞密度和活力自動分析系統 (Innovatis，Germany) 計數活細胞密度。采用流式細胞儀 (BD FACSCalibur，USA) 分析質粒轉染細胞和病毒感染細胞 EGFP的相對熒光強度(Relative fluorescence intensity，RFI)，每個檢測樣品的細胞總數設定為30 000。轉染陽性細胞的rhAPC表達水平分析參照文獻采用ELISA法進行[12]。

2 結果與分析

2.1 pQCXIN逆轉錄病毒表達載體的構建和鑒定

選用 AgeⅠ和 PacⅠ位點作為EGFP cDNA和rhAPC cDNA的克隆位點，分別將EGFP cDNA和rhAPC cDNA連入pQCXIN中，正確質粒結構如圖1A、1B所示，命名為 pQCXIN/EGFP和 pQCXIN/ rhAPC。所構建的表達載體經 AgeⅠ、PacⅠ酶切鑒定，分別出現與預期一致、長度約為700 bp和1 300 bp的片段 (圖2)。該結果經進一步的測序分析得到證實。

2.2 逆轉錄病毒表達載體介導的EGFP表達效率

圖1 pQCXIN逆轉錄病毒表達載體的結構示意圖Fig. 1 Diagrams of recombinant retroviral vectors. (A) pQCXIN/EGFP retroviral vector. (B) pQCXIN/rhAPC retroviral vector.

圖2 pQCXIN逆轉錄病毒表達載體的酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant retroviral vectors by enzyme digestion. 1: pQCXIN/rhAPC retroviral vector digested with Age I and Pac I; 2: pQCXIN/EGFP retroviral vector digested with Age I and Pac I; M: DNA marker.

分別用pcDNA3.1/EGFP質粒轉染的HEK293細胞和CHO-K1細胞，以及用經由pQCXIN/EGFP和pVSV-G共轉染GP2-293細胞制備的攜帶EGFP基因的重組逆轉錄病毒分別感染的 HEK293細胞和CHO-K1細胞，經過400 mg/L G418加壓篩選2周，收集細胞進行流式分析，考察逆轉錄病毒表達載體介導的EGFP表達效果。HEK293細胞經質粒轉染或病毒感染后，EGFP表達陽性細胞比例基本相同，約占細胞總數的 80%左右 (圖 3A、B)；病毒感染CHO-K1的 EGFP表達陽性細胞比例則明顯高于質粒轉染的 CHO-K1細胞 (圖 3C、D)。定量分析EGFP表達陽性細胞的相對熒光強度，病毒感染HEK293細胞和CHO-K1細胞的RFI均約為對應質粒轉染細胞的2倍 (圖3E)。

2.3 逆轉錄病毒表達載體反復感染HEK293細胞的EGFP表達

將經由 pQCXIN/EGFP和 pVSV-G共轉染GP2-293細胞制備的攜帶 EGFP基因的重組逆轉錄病毒一次感染后的HEK293細胞的RFI值設定為1，并據此考察逆轉錄病毒表達載體多輪反復感染HEK293細胞的EGFP表達。圖4為HEK293細胞經 2~4輪逆轉錄病毒表達載體反復感染后流式細胞分析的RFI相對值。RFI的相對值隨逆轉錄病毒表達載體感染次數的增加而升高，4輪病毒感染HEK293細胞的RFI值較1次病毒感染HEK293細胞的RFI值約提高2倍 (圖4)。結果提示，多輪反復感染逆轉錄病毒表達載體能通過增加HEK293細胞中EGFP基因的拷貝數提高EGFP的表達效率。

2.4 逆轉錄病毒表達載體介導的 EGFP表達穩定性

表1為質粒轉染或逆轉錄病毒表達載體感染的HEK293細胞在撤除 G418篩選壓力后連續傳代過程中的RFI值變化。經過6次連續傳代，質粒轉染HEK293細胞的RFI值由290.47降至88.89，下降幅度為 69.4%；經過 1到 4輪病毒感染 HEK293細胞的RFI值的下降幅度分別為44.5%、22.4%、37.5%和 21.5%。結果提示，逆轉錄病毒表達載體介導的外源基因表達的穩定性優于質粒轉染的外源基因表達。

圖3 質粒轉染或病毒感染介導的EGFP在HEK293細胞和CHO-K1細胞表達的流式細胞分析Fig. 3 Analysis the effect of EGFP expression in both HEK293 and CHO-K1 cells via plasmid transfection or virus infection. (A) Plasmid transfected HEK293 cells. (B) Virus infected HEK293 cells. (C) Plasmid transfected CHO-K1 cells. (D) Virus infected CHO-K1 cells. (E) RFI in both HEK293 and CHO-K1 cells via plasmid transfection or virus infection. Results are expressed as the mean value of duplicate samples from different experiment. EGFP: enhanced green fluorescent protein.

圖4 HEK293細胞經多輪反復逆轉錄病毒載體感染的EGFP表達情況Fig. 4 EGFP expression of the HEK293 cells with repeated virus infection. Results are expressed as the mean value of duplicate samples from different experiment.

2.5 逆轉錄病毒表達載體介導的rhAPC高效表達

分別用經由pQCXIN/rhAPC和pVSV-G共轉染GP2-293細胞制備的攜帶rhAPC基因的重組逆轉錄病毒感染 HEK293細胞和 pcDNA3.1/rhAPC質粒轉染HEK293細胞。經過400 mg/L G418加壓篩選2周，病毒感染和質粒轉染HEK293細胞的rhAPC表達水平分別為326.4 ng/(106cells·d) 和8.6 ng/(106cells·d)，逆轉錄病毒載體介導的rhAPC效率明顯高于質粒轉染介導的rhAPC表達 (表2)。在96孔板采用有限稀釋法對病毒感染HEK293細胞進行克隆并經ELISA篩選，獲得了3株rhAPC表達水平為10~15 μg/(106cells·d) 的HEK293細胞系。

3 討論

HEK293細胞為來源于人胚胎的轉化細胞系，其不僅體外培養性狀良好，且不存在嚙齒類病毒感染的潛在威脅。此外，HEK293細胞具有CHO細胞缺乏的γ-羧基化修飾和有效水解原肽以及表達完全人型塘基化的重組蛋白的能力。HEK293細胞的上述優點使其成為日益受到重視的生物技術藥物生產系統，采用HEK293細胞生產的重組蛋白藥物和重組腺病毒載體也已分別獲得FDA和SFDA的批準上市[3]。

表1 質粒轉染或病毒感染的HEK293細胞在連續傳代過程中的RFI值變化Table 1 Change of RFI of both plasmid transfected and virus infected HEK293 cells during continuous passage

表2 ELISA檢測病毒感染和質粒轉染的HEK293細胞的rhAPC表達水平Table 2 rhAPC expression in HEK293 cells infected by retrovirus or transfected by recombinant plasmid by ELISA

哺乳動物細胞的基因組非常龐大，其中包含為數眾多的外源基因整合位點，如CHO細胞基因組中大概有15 000個整合位點，但其中能使外源基因高效表達的轉錄活躍位點為數不多，大約只有15個位點[13]。通常的質粒轉染等方法只能將外源目的基因隨機整合到宿主細胞基因組內，因此，即使經過大量的篩選，獲得高效表達外源目的基因的細胞系的幾率仍非常低。

逆轉錄病毒載體攜帶的外源目的基因整合到宿主細胞時，整合位點通常位于DNase I高敏感性區域內的染色體開放區和轉錄活性區，這些區域與DNA的復制、轉錄和重組密切相關[14]。本研究的結果證實，對比質粒轉染介導的外源基因表達，逆轉錄病毒表達載體在介導外源基因表達的效率和穩定性方面均有明顯的優勢。此外，逆轉錄病毒表達載體介導的外源基因表達還可通過病毒的多輪感染有效地提高整合于宿主細胞轉錄活性區的外源基因的拷貝數。這一基因整合特性為外源目的基因的高效表達提供了可能，并由此大大提高了獲得到外源基因高效表達細胞系的幾率。雖然，逆轉錄病毒表達載體介導外源基因高效表達需要以操作相對繁瑣的高滴度病毒制備為前提，但仍不失為一種有發展潛力和應用前景的、能有效提高外源基因在哺乳動物細胞表達效率的技術途徑。

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