絲狀真菌次級代謝產物生物合成的表觀遺傳調控

周銳，廖國建，胡昌華

西南大學藥學院現代生物醫藥研究所，重慶 400716

絲狀真菌具有十分豐富的次級代謝產物合成能力，很多在醫藥上有重要應用價值的抗生素 (如青霉素和頭孢菌素)、降血脂藥物 (如洛伐他汀)、免疫抑制劑 (如環胞菌素) 等都是由真菌產生的。隨著真菌基因組的挖掘和次級代謝產物的生物合成研究越來越深入[1]，人們發現目前已知的絲狀真菌次級代謝產物只是真菌能夠合成的產物的冰山一角，比如分析構巢曲霉Aspergillus nidulans基因組，發現該菌具有產生27個聚酮類化合物，14個非核糖體多肽，1個萜類化合物以及兩個吲哚生物堿的潛力，然而目前的培養條件下，僅發現數個次級代謝產物[2]。這些在實驗室培養條件下未表達的生物合成基因簇被稱為沉默 (Cryptic) 基因簇，激活這些沉默的基因簇將極大地豐富絲狀真菌次級代謝產物的種類和數量，為新藥開發提供重要的先導化合物。

沉默的次級代謝生物合成基因簇的激活以及新次生代謝產物發現是目前真菌次級代謝產物研究的熱點與難點之一[3-4]，也是微生物菌種改良的一種新方法新策略[5]。無論是真菌還是原核生物鏈霉菌都可以通過改變發酵培養條件[6-7]、過表達次級代謝產物生物合成途徑特異性轉錄調控基因[8-9]，異源表達整個生物合成基因簇[10-11]得到新的化合物。近年來在鏈霉菌中發現，通過核糖體工程激活沉默基因簇的表達[12]，成為鏈霉菌次生代謝產物改構獲取新化合物的有效途徑，但在真菌中未見相關報道。最近的研究表明，絲狀真菌的次級代謝生物合成與其基因簇所處的表觀遺傳狀態有著密切的關系，通過表觀遺傳操作能大范圍改變微生物的次級代謝產物譜，激活大量次級代謝產物的生物合成，這將極大豐富絲狀真菌次級代謝產物的研究。本文綜述了絲狀真菌表觀遺傳研究的新進展，特別是其在真菌次生代謝生物合成和代謝產物開發中的應用。

1 絲狀真菌中的表觀遺傳

表觀遺傳是指在染色體中 DNA序列不發生變化的情況下，基因表達卻發生了可遺傳的改變，這種改變在發育和細胞增殖過程中能穩定地遺傳下去。表觀遺傳分子機制包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑以及RNA干擾等，這些變化在基因轉錄調控過程中扮演重要角色。表觀遺傳修飾在腫瘤細胞與組織中已得到普遍研究，但在真菌的形態與次生代謝的研究中剛起步。這些相關修飾中DNA甲基化和組蛋白修飾一直是表觀遺傳學領域的研究熱點，研究表明這兩類修飾與絲狀真菌的多種生理狀態密切相關。

1.1 DNA甲基化

DNA甲基化是指由 S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在DNA甲基轉移酶 (DNMTs) 作用下，基因組內 CpG 二核苷酸中胞嘧啶的 5位碳原子被甲基化形成 5-甲基胞嘧啶。它是一種真核生物中常見的DNA轉錄后堿基共價修飾過程。由于胞嘧啶5位碳原子引入了甲基，使得DNA分子構象發生了變化，影響了DNA與蛋白質分子的結合。在腫瘤細胞中，CpG島的高甲基化通常導致抑癌基因的失活，而去甲基化可激活抑癌基因的表達。在黃曲霉Aspergillus flavus和粗糙脈孢霉 Neurospora crassa中典型的DNA甲基化水平在0.25%~1.5%之間[13-14]。在同種真菌中不同的生長時期，甲基化水平也不盡相同。比如在毛霉 Phycomyces blakesleeanus的菌絲體階段，其基因組甲基化水平約 0.48%，而在其孢子階段，其甲基化水平為2.9%[15]。雖然DNA甲基化是一種遺傳性狀，然而這種遺傳性狀卻不甚穩定[16-17]。

1.2 組蛋白修飾

組蛋白是含量豐富的染色體相關蛋白，具有兩個重要的作用：作為核小體的組成部件，為DNA提供結合位點；另一個功能是它可以調控轉錄的起始。組蛋白的N-末端通過共價修飾作用發生甲基化、乙酰化、泛素化、SUMO化和磷酸化等翻譯后修飾，進而形成豐富的組蛋白密碼。

組蛋白乙酰化是最早被發現的，也是目前研究得最深入的與轉錄有關的組蛋白修飾方式。組蛋白乙酰化主要發生在組蛋白H3和H4的N-端尾部比較保守的賴氨酸殘基上，依靠組蛋白乙酰轉移酶(HAT) 和組蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 維持乙酰化的平衡。在正常情況下，組蛋白賴氨酸的氨基基團存在質子化現象，這促使帶正電荷的賴氨酸與帶負電荷的DNA因靜電效應而緊密結合；相反，組蛋白尾部賴氨酸殘基被乙酰化能夠使組蛋白攜帶的正電荷量減少，降低其與帶負電荷 DNA 鏈的親和性，促使參與轉錄調控的各種蛋白因子與DNA結合[18]。根據賴氨酸與DNA鏈的親和力不同，而調控轉錄的“開”“關”，最終控制基因的表達或沉默。

組蛋白甲基化是通過組蛋白甲基轉移酶(Histone methyltransferase，HMTs) 和去甲基化酶(Demethylase) 的相互作用，動態地調節組蛋白的甲基化狀態，并且與其他功能蛋白的相互作用，來調控基因轉錄激活或抑制生物學過程。與組蛋白賴氨酸乙酰化促進基因表達不同，組蛋白賴氨酸甲基化對基因表達的影響比較復雜，它們中有些可以促進基因表達，有些可以抑制基因表達，取決于它所位于的殘基情況。如在很多真核生物中，H3K9的甲基化通常是異染色質形成的標志，并且導致基因沉默[19]，但是在一些真菌中組蛋白甲基化是菌種正常生長的必要條件，如在煙曲霉中，敲除編碼 H3K9甲基化酶的基因 (clrD) 會降低菌落的生長半徑，推遲brlA的表達從而影響分生孢子的產生[20]；在粗糙脈孢霉中，H3K36甲基化是其正常發育所必需的[21]。

2 表觀遺傳修飾與次級代謝產物生物合成

研究發現真菌次級代謝生物合成基因簇常處于異染色質狀態，并且位于端粒附近，其結構基因可能受表觀遺傳調控。絲狀真菌基因組的 DNA甲基化、組蛋白的乙酰化和甲基化都與次級代謝產物的生物合成密切相關，不僅影響次級代謝產物的產量，還能激活大量沉默的次級代謝產物生物合成基因簇的表達。

2.1 組蛋白去乙酰化與次級代謝產物生物合成

表觀遺傳修飾對真菌次級代謝產物影響的直接證據來自通過分子遺傳學手段阻斷構巢曲霉的3種類型的HDACs (HdaA，HosB，HstA)。構巢曲霉能產生多種次級代謝產物，包括青霉素、norsolorinic acid和 terrequinone A。阻斷 hosB (真菌特異的HOS3-like HDAC) 和hstA (sirtuin的同源體) 對真菌次級代謝沒有顯著的影響，而阻斷hdaA (保守的class II HDAC) 后顯著地提高norsolorinic acid和青霉素的產量。同時失去這3種HDACs的突變株的norsolorinic acid產量進一步提高，令人驚訝的是青霉素的產量卻沒有顯著地改變[22]。在上述的所有突變株中，terrequinone A的產量都沒有明顯的變化。HADCs對構巢曲霉不同次級代謝產物產量的影響可能是與這 3種次級代謝產物生物合成簇在基因組上的位置有關。青霉素和norsolorinic acid的合成基因簇位于染色體Ⅵ和Ⅳ靠近端粒的100 kb以內，并且其周圍含有保守的DNA重復序列，這些特征是亞端粒區域的典型特征。而terraquinone A的合成簇位于染色體Ⅴ的遠端，離端粒的距離約700 kb。與構巢曲霉類似，在煙曲霉A. fumigatus中敲除hdaA也可提高多種次級代謝產物的產量，對煙曲霉14個非核糖體肽合成酶 (NRPS) 進行RT-PCR分析發現，HdaA對9個NRPS有調控作用，對包括制霉菌素在內的 4個 NRPS存在正調控作用，對另外 5個NRPS為負調控，但是通過分析14個NRPS基因與端粒位置的關系發現，NRPS在染色質上的定位與其是否受 hdaA調控沒有相關性[23]。因此，次級代謝生物合成基因簇在基因組位置是否具有表觀遺傳修飾的偏好，需要在更多的真菌系統中進行深入研究。

2.2 組蛋白甲基化與次級代謝產物生物合成

組蛋白的甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，有廣泛的生物學功能。Bre2是釀酒酵母中催化組蛋白H3K4甲基化的含Set1的COMPASS復合物的一個組分。bre2在構巢曲霉中的同源體是cclA。cclA阻斷突變株H3K4的二甲基化和三甲基化顯著降低，并伴隨著 H3K9的二甲基化和三甲基化降低。cclA阻斷突變株至少激活了 2條沉默基因簇的表達，產生 8種新化合物，包括 mondeictyphenone、幾種大黃素同系物、芳香聚酮F9775A和F9775B等[24]。

除了cclA外，在曲霉中還發現了一個可能的組蛋白甲基轉移酶 LaeA。LaeA是首先在曲霉中發現的細胞核蛋白，含有一個保守的S腺苷甲硫氨酸的作用位點[25]。LaeA僅存在于絲狀真菌中，如曲霉(A. terreus，A. nidulans，A. fumigatus，A. flavus) 和青霉Penicillium chrysogenum，在釀酒酵母中則沒有發現laeA的存在。LaeA是一個重要全局調控因子，不僅控制了菌體形態而且決定了多種次級代謝產物的表達量。在土曲霉中，LaeA正調控洛伐他汀(Lovastatin) 的生物合成，當敲除 laeA時，洛伐他汀的產量顯著降低；在構巢曲霉中，LaeA不僅可以正調控sterigmatocystin和青霉素的生物合成，還可以調控異源表達的洛伐他汀生物合成基因簇的表達[2]。在構巢曲霉中過表達laeA可導致ipnA (編碼異青霉素 N合成酶)、lovE (編碼洛伐他汀特異的Zn2 Cys6轉錄因子) 和lovC (編碼洛伐他汀聚酮合酶) 也隨之高表達，但是 stcU (編碼sterigmatocystin生物合成所必需的酶) 的表達量卻沒有變化；在土曲霉中過表達laeA導致洛伐他汀的量提高了400%到 700%[2,25]。通過比較構巢曲霉 laeA過表達菌株和缺失菌株的代謝譜圖，成功地發現了編碼terrequinone A的生物合成基因簇[2]，而通過基因芯片分析煙曲霉的野生型和laeA阻斷突變株的轉錄譜發現，煙曲霉基因組中的22個次級代謝生物合成基因簇中的13個受LaeA的調控，包括正調控煙曲霉主要毒素-膠黏毒素 (Gliotoxin) 的生物合成[26]。laeA 的阻斷突變株不僅次級代謝產物合成受到影響，還對真菌的形態分化產生影響。在液體培養基條件下，突變株的分生孢子的生長受到影響，分生孢子表面突起明顯減少[27]。在產黃青霉中，laeA正調控青霉素和色素的生物合成并影響孢子的形成，過表達 laeA能顯著地提高青霉素的產量[28]。鑒于LaeA在真菌次級代謝產物生物合成過程的重要作用，本實驗室從產美伐他汀的橘青霉 Penicillium citrinum中克隆了laeA基因，序列分析顯示與產黃青霉的laeA有95%的同源性，并發現laeA的表達與美伐他汀的生物合成正相關[29]。盡管 LaeA對真菌的次級代謝有重要的影響，但是LaeA的具體作用機制還不甚清楚。由于LaeA的蛋白序列與組蛋白甲基轉移酶有同源性，提示 LaeA可能參與了組蛋白修飾；而且LaeA作用靶點大都位于基因組上的亞端粒區，因此可能通過染色體的重排來發揮作用。

2.3 組蛋白SUMO化與次級代謝產物生物合成

SUMO化是真核細胞中一種重要的翻譯后修飾，影響很多重要的細胞過程，如調節基因的轉錄和染色體的結構。SUMO是類似泛素的小蛋白，能共價結合到很多蛋白質上，包括組蛋白等。敲除構巢曲霉基因sumO，可顯著影響該菌的次級代謝，其中asperthecin的表達量提高近200倍，而austinol，dehydroaustinol和 sterigmatocystin的表達量分別降低21倍、10倍和54倍。然而emericellamides的表達量沒有改變[30]。由于SUMO化的作用靶點的多樣性，還需要進一步研究來確定SUMO化是直接作用次級代謝產物生物合成簇，還是通過未知的靶點從而間接影響次級代謝產物的生物合成。

3 化學表觀修飾劑在絲狀真菌次級代謝產物研究中的應用

通過分子遺傳學手段直接阻斷和高表達表觀遺傳學靶點能夠有效地確定目的靶點與次級代謝生物合成之間的關系，提高抗生素的產量和發現新的次級代謝產物。然而，除了少數模式真菌 (如曲霉和青霉) 外，很多的絲狀真菌都缺乏高效的遺傳操作系統，因此在目前的技術條件下，很難使用分子遺傳學手段研究非模式真菌的表觀遺傳。隨著研究的深入，一系列的小分子物質被篩選出來特異性地或者半特異性地抑制表觀遺傳修飾酶類，從而形成了一門新的學科——化學表觀遺傳學 (Chemical epigenetics)。雖然這些小分子物質都是用來針對人類疾病的重要靶點，但是它們在很多真菌的對應靶點上也有較好的效果。控制表觀遺傳靶點的小分子能夠影響多種生理過程，其中包括對次級代謝產物生物合成的調控。

3.1 DNA甲基轉移酶抑制劑對次級代謝生物合成的影響

在真菌細胞中，DNA甲基化與去甲基化是受DNA甲基轉移酶和DNA去甲基化酶調控的一個動態平衡過程。利用DNA甲基轉移酶抑制劑可激活真菌的沉默基因的表達，如利用 5雜氮胞苷、5雜氮脫氧胞苷兩種 DNA甲基轉移酶抑制劑激活了裂褶菌Schizophyllum commune[31]和粗糙脈胞菌中的潮霉素抗性基因[32]，黃孢原毛平革菌 Phanerochaete chrysosporium中的腐草霉素抗性基因[33]。Mooibroek等[31]先后使用了5種DNA甲基轉移酶抑制劑，5雜氮胞苷、5雜氮脫氧胞苷、甲硫腺苷、西奈芬凈、S-腺苷高半胱氨酸，分別對12種真菌，包括2種曲霉 (A. flavus，A. westerdijkiae)，1種枝孢霉Cladosporium cladosporioides， 1 種 粘 帚 霉Clonostachys sp.，1種膠孢殼Diatrype sp.，2種青霉(產黃青霉和桔青霉)，一種根霉 Rhizopus sp.，1種輪枝菌Verticillium psalliotae和3株未鑒定的真菌進行表觀遺傳修飾。結果顯示12種真菌中的11種對表觀遺傳修飾有反應，提高了部分次級代謝產物的產量，并可能激活了新的化合物合成。選擇其中的兩株真菌 (C. cladosporioides和Diatrype sp.) 進行大規模發酵，結果表明使用 5雜氮胞苷誘導 C. cladosporioides得到了未誘導菌株本身不產生的氧脂素 (Oxylipin)，誘導Diatrype sp.得到了兩種新型糖基化聚酮化合物。上述研究表明5雜氮胞苷作為DNA甲基轉移酶抑制劑可提高多種真菌中的次級代謝產物產量和獲取新型化合物，也證明了利用小分子的 DNA甲基轉移酶抑制劑作為真菌新型化合物開發的工具具有很大的可行性。

3.2 組蛋白去乙酰化酶抑制劑對次級代謝生物合成的影響

組蛋白的乙酰化可激活沉默基因，促進基因的轉錄與表達，因此通過小分子化學試劑抑制組蛋白的去乙酰化，提高組蛋白乙酰化水平，有可能促進基因的表達。使用不同的組蛋白去乙酰化酶抑制劑分別作用上述的 12種真菌，結果表明曲古柳菌素A (Trichostatin A) 和伏立諾他 (Suberoylanilide hydroxamic acid ，SAHA)有較好的提高已有次級代謝產物表達和激活新的次級代謝產物合成的能力。Williams等使用SAHA誘導C. cladosporioides得到了7種首次在該菌中發現的perylenequionone化合物[34]。Henrikson等新近使用 SAHA誘導黑曲霉也獲得了全新的天然產物Nygerone A[35]。進一步的轉錄譜研究表明，黑曲霉培養基中添加SAHA大幅上調了14個生物合成基因簇的表達，其中13個基因簇位于端粒附近1.5 Mb內[36]，這與HADCs突變所獲得的結論一致，說明組蛋白乙酰化對黑曲霉次級代謝生物合成基因簇的調節具有較強的能力并且可能有位置上的偏好。

4 展望

使用重要表觀遺傳修飾酶類的小分子抑制劑和通過分子遺傳學手段直接控制表觀遺傳修飾酶類的表達水平是目前采用的兩種主要方法。這兩種方法各有利弊，都成功地獲得了新的次級代謝產物。使用小分子抑制劑的方法操作簡單，投入成本低，適用于模式真菌以及遺傳背景模糊的真菌，能夠進行高通量的篩選。然而其缺點也很明顯，很多真菌對小分子抑制劑有抗性作用，并且通過這種方法實現的表觀遺傳修飾，在傳代中很不穩定。相比之下，通過分子水平的操作來進行表觀遺傳修飾，遺傳穩定性大大提高，但是這種方法十分繁瑣，并且要求對菌株的遺傳背景有充分的了解，具有相應的技術平臺，因此該種方法不容易實現和普及。可將二者結合起來，先使用小分子抑制劑來測試表觀遺傳修飾是否可以影響次級代謝產物的生物合成，然后可通過分子水平操作來靶向改變表觀遺傳酶類的表達，以達到提高目的代謝產物的表達水平和獲取新化合物的目的。

表觀遺傳研究是近年來生命科學領域研究熱點，在植物、動物、人類疾病幾個方面已取得較大進展，我國已于2009年啟動了重大研究計劃《細胞編程和重編程的表觀遺傳機制》，新近2011年植物表觀遺傳機制也納入了重大研究計劃中。真菌作為真核生物的大類群和新藥開發重要資源，其表觀遺傳研究剛剛起步，我們有理由相信，對真菌表觀遺傳學的深入研究不僅會豐富和推動真核生物表觀遺傳學的內容和發展，也會極大地促進真菌系統進化的研究和基因沉默問題的解決，更會為新藥開發提供更多的先導化合物，以增加我國創制原創新藥的競爭力。

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