一種拮抗HIV-1并靶向DC的融合基因的設計及表達鑒定

趙萌，徐青，于繼云，余云舟

1 北京交通大學生命科學與生物工程研究院，北京 100044

2 軍事醫學科學院基礎醫學研究所，北京 100850

3 軍事醫學科學院生物工程研究所，北京 100071

HIV (Human immunodeficiency virus) 屬于慢病毒屬，是一種潛伏期極長的逆轉錄病毒，它可以通過感染 CD4+T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞 (DC)等使機體免疫系統受損，最終導致患者艾滋病(AIDS) 的發生。艾滋病的蔓延對全世界人類健康和社會經濟的發展構成了巨大的威脅，而目前尚無能夠徹底治療艾滋病的藥物和預防的疫苗。HIV通過一系列連續的過程進入宿主細胞，HIV病毒主要表面蛋白gp120首先與細胞表面的分子CD4結合，使HIV外膜復合物發生結構改變，然后與細胞表面的趨化因子輔助受體CCR5或CXCR4結合，使病毒與宿主細胞膜接近和融合[1-2]。近些年在對于艾滋病人的治療中發現HIV-1抗原刺激DC所誘導的免疫可以控制血漿病毒載量并有效殺傷 HIV-1感染的細胞，并且研究發現成熟的DC可以增強機體T細胞對于HIV-1的免疫應答[3]。Flt3-L可以極大刺激DC增殖、分化和成熟，在 DC靶向疫苗的研究中可以增強DC對HIV抗原遞呈作用[4-5]。趨化因子Mip-3α直接參與了DC細胞和T細胞的定向遷移，近期的研究發現Mip-3α還具有抗 HIV-1活性[6-7]。本研究中，首先設計了一個包含CD4和CCR5與gp120結合的主要功能結構區及Flt3-L和Mip-3α分子的融合基因，目的是通過融合基因表達的CD4和CCR5與HIV表面蛋白gp120的雙重結合，捕獲病毒分子，從而阻斷病毒進入靶細胞內，然后通過Mip-3α對DC的趨化作用，將捕獲的病毒分子靶向 DC，從而抑制和清除病毒。其次我們體外合成了全長的基因分子，并分別構建了包含 pABK-CKR5-CD4/ Flt3-L-Mip-3α (pABK-HIV-MF) 和pABK-CKR5-CD4 (pABK-HIV-MT) 的真核表達載體。pABK-HIV-MF表達的是全長的融合基因，而構建 pABK-HIV-MT的目的是輔助性檢測 CKR5和 CD4的融合蛋白與gp120在體外是否能夠有效結合。最后，我們在真核細胞中成功地表達了所構建的載體，為下一步研究融合蛋白對HIV-1的拮抗及靶向DC清除作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎 293細胞、真核表達載體 pABK和pVAX-1-s-CD4為本實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態細胞購自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 pABK-HIV-MT和pABK-HIV-MF真核表達載體的構建

全長融合基因序列由北京擎科生物技術公司合成，合成的基因DNA連接在T-EASY載體上。擴增HIV-MT和 HIV-MF融合基因的上游引物均包含BamHⅠ酶切位點，下游引物均包含XbaⅠ的酶切位點，引物均由生工生物工程上海有限公司合成，引物序列參照表1。PCR、質粒提取、DNA酶切、連接和轉化等操作方法參照相關試劑說明書和《分子克隆實驗指南》[8]。實驗中的連接酶，DNA限制性內切酶BamHⅠ和XbaⅠ購自New England Biolabs公司；2×Pfu PCR MasterMix，轉染用小量及中量質粒提取試劑盒購自天根公司。

1.2.2 細胞培養和轉染

人胚腎 293細胞的培養使用 Freestyle?293 Expression Medium (Gibico)，待細胞密度生長至1×109個/L時，轉染質粒。轉染試劑使用293fectin?(Invitrogen)，按試劑盒說明進行操作。

1.2.3 RT-PCR檢測HIV-MF在細胞內轉錄

轉染 48 h后收獲轉染 HIV-MF質粒的人胚腎293細胞，每孔加入TRIzol試劑提取細胞總RNA。取細胞總RNA 5 μL，按照Invitrogen SuperScript?III Reverse Transcriptase (Invitrogen) 的產品說明進行反轉錄實驗。引物序列參照表1，其中GAPDH特異性上下游引物和Oligo(dT)20購自東洋紡公司。

1.2.4 間接免疫熒光

轉染后24 h，取轉染質粒的人胚腎293細胞懸液1 mL移入6孔板，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，沉淀細胞，在?20 ℃用5%醋酸 (溶于甲醇) 固定細胞；1% BSA (含0.5% Triton-100) 孵育10 min，PBS洗3次；1% BSA封閉1 h后，加入1∶250稀釋的兔抗人CD4一抗 (Santa Cruz)，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次后，加溶于1%伊文氏藍及1% BSA中1∶200稀釋的 FITC-山羊抗兔二抗 (中杉金橋)，37 ℃孵育0.5 h，PBST洗3次；在熒光鏡下觀察并照相。

1.2.5 ELISA

轉染后72 h，取細胞懸液，離心，分別分離上清與細胞沉淀。上清使用0.45 μm濾膜過濾后可直接作樣品，細胞總蛋白的提取參照細胞裂解液(Promega) 說明書。將蛋白樣品分別與 PBS等體積混合后，加入96孔板中，每孔100 μL，每組樣品設2個平行，4 ℃包被過夜后，2% BSA封閉2 h；PBS洗2次后，每孔加入100 μL的1∶100稀釋兔抗人CD4一抗，37 ℃孵育1 h；PBST洗4次后，每孔加入50 μL的1∶2 000稀釋HRP-山羊抗兔二抗 (中杉金橋)，37 ℃孵育1 h；PBST洗4次，PBS洗1次后OPD室溫顯色10 min，用BioRad酶聯儀檢測492 nm和630 nm的A值。

1.2.6 Western blotting

轉染后 72 h，收集細胞，采用細胞裂解液(Promega) 提取胞內總蛋白。將蛋白樣品與電泳上樣緩沖液混合后沸水煮5 min，立即置于冰上5 min，短暫離心。細胞總蛋白的上樣量為每泳道20 μg，10% SDS-PAGE膠分離樣品，200 mA濕轉2 h至PVDF膜上；室溫封閉2 h后，將膜與5%脫脂奶粉1∶5 000稀釋的鼠抗 His標簽一抗 (中杉金橋) 和1∶10 000稀釋的鼠抗β-Tubulin一抗 (Abmart) 4 ℃共同孵育過夜；PBST洗膜3次，將膜與1：10 000稀釋的 HRP-山羊抗鼠二抗 (Santa Cruz) 室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后；加入ECL試劑，室溫反應5 min，暗室曝光，顯影，定影。

2 結果

2.1 HIV-1拮抗并靶向 DC的融合基因的設計和合成

本實驗中我們設計了一個能夠捕獲HIV-1并靶向DC的融合基因，包含CD4等4個分子，其中CD4和CCR5能夠與HIV-1特異性結合，可以阻斷HIV的膜蛋白gp120與靶細胞表面受體結合，而Mip-3α分子可以募集DC，Flt3-L分子則能夠刺激DC的增殖。在4個不同的分子間，加入了連接序列，避免所表達分子間的相互作用。另外，為了方便融合蛋白的檢測和純化，我們在融合基因 3末端加入了 6個組氨酸構成的標簽。在GenBank中獲取了對應基因的核酸序列，各序列詳細信息見表 2。融合基因全長2 232 bp，序列的一級結構分析 (www.expasy. org) 表明融合基因對應蛋白的分子量約84 kDa。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

表2 HIV-MF融合基因中各組分信息Table 2 Information of each component in HIV-MF

圖1 HIV-MF融合基因結構Fig. 1 Component included in HIV-MF.

2.2 真核表達載體的鑒定

電泳結果顯示，重組質粒 pABK-HIV-MT和pABK-HIV-MF用BamHⅠ和XbaⅠ酶切后，條帶分別與載體和目的片段大小一致 (圖 2)。測序分析表明重組質粒序列正確，表明重組質粒構建成功。

2.3 HIV-MF的轉錄結果

圖2 重組質粒pABK-HIV-MT和pABK-HIV-MF的酶切鑒定Fig. 2 Digestion of pABK-HIV-MT and pABK-HIV-MF. M: DNA marker; 1: pABK-HIV-MT plasmid; 2: pABK-HIV-MT digested with BamH I/Xba I; 3: pABK-HIV-MF plasmid; 4: pABK-HIV-MF digested with BamH I/Xba I.

用重組質粒pABK-HIV-MF轉染人胚腎293細胞，RT-PCR檢測重組質粒在細胞中的轉錄。pABK-HIV-MF重組質粒在2 244 bp左右有擴增條帶，轉染 pABK-HIV-MF組和 pABK空載體組有GAPDH的擴增條帶，以水為模板的空白對照組和未添加反轉錄酶處理的所有樣品 (圖略) 均無對應擴增條帶，表明pABK-HIV-MF在細胞中得到了特異的轉錄。

2.4 融合基因表達的間接免疫熒光檢測結果

間接免疫熒光檢測結果顯示陽性對照 (轉染pVAX-1-s-CD4真核表達載體) 及轉染 pABKHIV-MT和pABK-HIV-MF的人胚腎293細胞在鏡下觀察有染色 (圖 4)，而未轉染重組質粒組沒有染色，表明融合基因HIV-MT和HIV-MF在細胞中得到了特異表達。

圖3 HIV-MF融合基因的RT-PCR產物Fig. 3 RT-PCR product of HIV-MF. M: DNA marker; 1: amplification of water by GAPDH primer; 2: amplification of water by specific primer; 3: amplification of pABK group by GAPDH primer; 4: amplification of pABK group by specific primer; 5: amplification of pABK-HIV-MF group by GAPDH primer; 6: amplification of pABK-HIV-MF group by specific primer.

2.5 融合基因表達的ELISA檢測結果

因為真核表達載體pABK中帶有一段信號肽，可以使得表達的蛋白分泌到細胞外，所以細胞上清中會有表達的蛋白。我們采用間接ELISA法進一步驗證融合基因HIV-MT和HIV-MF在細胞內和培養上清中的表達情況。通過包被細胞總蛋白和培養上清，用CD4作為一抗孵育，每個樣品組設2個平行孔。同時設置多組對照組：一抗對照 (不加二抗只加一抗)，二抗對照 (不加一抗只加二抗)，陰性對照(未轉染組)。如圖5所示，轉染pABK-HIV-MT和pABK-HIV-MF的培養上清和細胞內總蛋白CD4抗體檢測結果呈陽性，未處理組和所有對照組呈陰性，表明融合蛋白在人胚腎 293細胞中得到了特異表達，并且分泌到了細胞外。

2.6 HIV-MF的Western blotting結果

為了進一步檢測HIV-MF在人胚腎293細胞中的表達及估計其蛋白分子量的大小，我們用抗 His標簽和抗β-Tubulin內參抗體對轉染HIV-MF真核表達載體后人胚腎 293細胞的胞內總蛋白進行了Western blotting分析，結果顯示轉染HIV-MF真核表達載體組存在特異性條帶和內參條帶，而對照組只見內參條帶 (圖6)，其結果確定了HIV-MF融合基因在人胚腎293細胞中獲得了正確的表達。

3 討論

目前美國FDA批準用于治療HIV-1的藥物主要是逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，這兩種藥物在使用中均有不良反應，很難抑制病毒的復制，且極易導致病毒變異，出現耐藥。而HIV進入/融合抑制類藥物由于不受耐藥性影響，成為非常有吸引力的藥物研制方向。HIV通過外膜蛋白 gpl20與靶細胞表面的CD4受體及趨化因子受體CCR5和CXCR4結合進入細胞，因此與 gpl20結合的高度保守區域為 HIV進入/融合抑制類藥物作用提供了靶點。其中，PRO542是由CD4的Dl～D2區和天然抗體IgG2的保守區融合而成的重組蛋白，正處于Ⅱ期臨床研究階段。另一種抗CD4的單克隆抗體Ibalizumab可阻斷HIV-1與細胞表面受體CD4結合，在一期臨床實驗中也獲得了較好的抗病毒效應。而 Maraviroc作為第一個CCR5拮抗劑已于2007年8月被美國FDA批準上市[9-10]，隨訪結果顯示Maraviroc具有良好的安全性和抗病毒效應[11]。

圖4 融合基因的間接免疫熒光檢測結果Fig. 4 Immunofluorescent assay of the fusion gene expressing in cells. (A) Transfected with plasmid pABK-HIV-MT. (B) Transfected with plasmid HIV-MF. (C) Transfected with plasmid pVAX-1-s-CD4 (positive control). (D) Untreated group (negative control).

圖5 融合蛋白表達的ELISA檢測結果Fig. 5 ELISA analysis of the fusion gene in cells. 1: culture medium of HEK293 transfected with plasmid pABK-HIV-MT; 2: culture medium of HEK293 transfected with plasmid pABK-HIV-MF; 3: intracellular protein of HEK293 transfected with plasmid pABK-HIV-MT; 4: intracellular protein of HEK293 transfected with plasmid pABK-HIV-MF; 5: untransfected group.

圖6 融合蛋白HIV-MF表達的Western blotting鑒定Fig. 6 Western blotting of fusion protein HIV-MF in cells. 1: intracellular protein of HEK293 transfected with plasmid pABK-HIV-MF; 2: untreated group.

根據上述的研究結果，本研究中我們設計的融合基因HIV-MF理論上可以通過CD4和CCR5與HIV表面蛋白gp120的雙重結合，捕獲病毒分子，然后通過Mip-3α對DC的趨化作用，將捕獲的病毒分子靶向DC，從而抑制和清除病毒，而Flt3-L分子則可以刺激DC的增殖、分化和成熟，增強DC對HIV抗原遞呈作用。本研究采用多種不同的方法來檢測HIV-MF在細胞中的表達情況，不同的檢測方法得到了一致的結果，說明含融合基因的真核表達載體已被成功構建并在細胞中獲得了正確的表達，為研究融合蛋白對HIV-1的的拮抗及靶向DC的作用奠定了基礎。下一步我們將純化融合蛋白HIV-MT和 HIV-MF，首先在體外檢測它們是否可與 gp120結合，然后驗證其對HIV的捕獲以及HIV-MF分子是否可以募集，并刺激DC的增殖和分化。

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