細胞珠蛋白對肝星狀細胞氧化損傷的保護作用

呂穎慧，王啟釗，李招發，刁勇，許瑞安

1 華僑大學分子藥物學研究所，泉州 362021

2 分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021

細胞珠蛋白 (Cytoglobin，Cygb) 是新近發現的哺乳動物中4種球蛋白 (Globin) 之一，由190個氨基酸殘基組成，分子量21.4 kDa，編碼基因定位于染色體17q25[1]。Cygb最初由Kawada等在大鼠肝星狀細胞 (Hepatic stellate cells，HSC) 中發現，且證實不論在活體或者離體狀態，Cygb蛋白與其mRNA均顯著上調，故 Cygb初期僅被認為可以作為判斷HSC激活和診斷肝纖維化與肝硬化的一個標記物而己[2]。我們的前期研究首次證明Cygb不僅具有預防肝纖維化的作用，還能有效實現肝纖維化的逆轉，且其作用與協調肝臟中細胞間的氧化應激密切相關[3-6]；最近的研究表明 Cygb在腎臟中也能發揮顯著的抗纖維化作用，這種作用同樣通過減小腎臟中的氧化應激實現[7]，提示其抗氧化功能在對抗組織纖維化中的重要作用。本課題組早期已成功克隆cygb基因[8]，并已建立成熟的體外表達純化大量Cygb蛋白的有效方法[9-10]，為進一步闡明 Cygb這一功能基因在肝纖維化、肝硬化中的抗氧化治療作用提供了有利條件。

眾所周知，肝臟中存在著機制復雜的氧化應激反應，并且在肝纖維化進程中，中心環節——肝星狀細胞發生由靜息態向活化態的轉變。因此，探討Cygb蛋白在肝臟氧化損傷中的具體保護作用及機制必須要考慮到上述的復雜因素。本研究采用了過氧化氫及鐵過載兩種不同作用機制的氧化反應模型來模擬肝臟內的實際氧化刺激環境。其中過氧化氫主要模擬在肝臟中廣泛存在的 H2O2活性氧中間體；鐵過載模型則主要用以觸發肝臟內的脂質過氧化反應，鐵與花生四烯酸的協同增效反應主要發生于酒精性脂肪肝誘發的肝纖維化進程中。這兩種模型基本可以代表在肝臟中的主要氧化應激分子作用。本實驗還選取了兩種不同活化狀態的肝星狀細胞——未完全活化的原代大鼠肝星狀細胞 (Rat hepatic stellate cells，rHSC) 及完全活化的人肝星狀細胞系 (LX-2) 為研究對象，較全面揭示Cygb蛋白在肝纖維化中的抗氧化作用及機制，并探討將其應用于肝纖維化抗氧化治療中的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

Cygb質粒 (pCygb) 與EGFP質粒 (pEGFP) 為本實驗室構建并保存；SD大鼠購自福建吳氏實驗動物中心；人肝星狀細胞系LX-2購自上海天呈科技有限公司；膠原酶、Nycodenz、肝素鈉、花生四烯酸(AA)、次氮基三乙酸 (NTA)、硝酸鐵 (Fe(NO3)3)、MTT試劑購自Sigma公司；鏈霉蛋白酶購自Roche公司；OPTI-MEM I及 Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；DMEM、DnaseⅠ及胎牛血清均購自 Hyclone公司；desmin及 α-SMA 抗體購自SantaCruz公司；兔抗CYGB抗體由Kawada博士惠贈；超氧化物陰離子熒光探針 (Dihydroethidium)購自碧云天生物技術研究所；其余生化試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

rHSC分離培養采用本實驗室已報道的方法[4,11]，分離純化后的細胞經臺盼藍鑒定存活率＞95%， desmin及 α-SMA免疫細胞化學染色鑒定純度＞95%，可滿足實驗需求。rHSC培養48 h后換液，然后每2~3 d換液1次，本文中應用分離后體外培養5 d的rHSC進行實驗。人肝星狀細胞系LX-2培養于含20%胎牛血清的DMEM培養液。

1.2.2 Cygb蛋白制備

Cygb蛋白制備參照本實驗室已成功建立的方法[9-10]。

1.2.3 H2O2作用

細胞均以1.0×108/L接種于96孔板，100 μL/孔。培養過夜后，加入終濃度為 200 μmol/L的 H2O2于 37 ℃作用 48 h，行 MTT檢驗。Cygb蛋白(10 mg/L，50 mg/L) 或維生素 E (VE，50 μmol/L)分別于H2O2處理前30 min或H2O2處理后30 min加入培養液中。

1.2.4 Fe-NTA/AA作用

Fe-NTA溶液配制參照文獻[12]。簡述如下：取5 mL 50 mmol/L Fe(NO3)3溶液與5 mL 150 mmol/L NTA溶液混合，用1 mol/L碳酸氫鈉溶液調節pH值至7.4，定容至20 mL，得25 mmol/L Fe-NTA母液，現配現用。細胞均以 1.0×108/L接種于 96孔板，100 μL/孔。培養過夜后，用DMEM培養液或含有終濃度20 μmol/L AA的培養液換液，繼續培養16 h后，吸除培養液并用D-hank’s緩沖液沖洗細胞以去除殘留的AA，然后分別加入含終濃度為1 000 μmol/L或100 μmol/L Fe-NTA的DMEM培養液，到既定時間后進行結晶紫檢測。Cygb蛋白(10 mg/L，50 mg/L)于 Fe-NTA處理前 30 min或Fe-NTA處理后30 min加入培養液中。

1.2.5 細胞毒性實驗

分別用 MTT檢驗及結晶紫染色檢測過氧化氫或鐵過載對肝星狀細胞的毒性作用。MTT檢驗中，向每孔細胞中加入10 μL (96孔板) 5 mg/mL MTT試劑，繼續培養4 h，終止培養，吸棄培養液，每孔加入100 μL (96孔板) DMSO，振蕩使結晶物充分溶解，于酶標儀492 nm處測OD值，以630 nm作參比波長；結晶紫染色中，細胞用10%甲醛固定30 s，1×PBS漂洗2次；加入結晶紫染液孵育10 min，1×PBS漂洗5遍，然后加入33%乙酸水溶液溶解，570 nm讀數。實驗中設置6個平行樣，重復3次。用未經抗氧化物或氧化物處理的細胞作為對照(Control)，相對增殖率 (Ralative growth rate，RGR)用以下公式計算：

1.2.6 細胞內超氧化物檢測

細胞相應處理后，除去培養液，用D-Hank’s緩沖液沖洗兩遍，然后加入 10 μmol/L的超氧化物陰離子熒光探針 (Dihydroethidium) 工作液，37 ℃孵育60 min，用D-Hank’s緩沖液沖洗2遍，熒光顯微鏡綠色激發觀察。

1.2.7 RNA干擾實驗

對照siRNA (NC) 及Cygb干擾RNA (si1&si2)以雙鏈 RNA形式由上海吉瑪公司合成 (每 OD siRNA中加入150 μL DEPC水，配成20 μmol/L母液，分裝，?20 ℃保存備用)。采用Lipofectamine 2000轉染，按照說明書操作，簡述如下：在無雙抗培養基中接種LX-2細胞，轉染時細胞匯合度達30%~50%，用適量無血清 OPTI-MEM I培養基稀釋相應 siRNA (終濃度 100 nmol/L)，混勻。搖勻Lipofectamine 2000，取適量用 OPTI-MEM I稀釋并輕輕混勻后室溫孵育5 min。將稀釋的siRNA和稀釋的 Lipofectamine 2000混合，室溫孵育20 min后加入細胞培養板中，37 ℃、CO2培養箱孵育48 h后提取總RNA行RT-PCR檢驗并用real-time PCR定量分析 (n=3)；72 h后提取總蛋白進行Western blotting檢驗并用凝膠成像系統對條帶進行分析。應用篩選得到的有效siRNA按上述方法轉染48 h后分別加入相應濃度的H2O2或Fe-NTA/AA作用。設計得到的siRNA序列如表1所示。

表1 設計得到的siRNA序列Table 1 Designed sequences of siRNAs

1.2.8 基因轉染實驗

pCygb及pEGFP分別轉染LX-2細胞后48 h加入氧化刺激物，繼續作用24 h進行檢測。用過氧化氫刺激的細胞行MTT檢測，用Fe-NTA/AA刺激的細胞行結晶紫檢測。

1.2.9 數據統計

2 結果

2.1 內源性 Cygb蛋白對于氧化反應引起的肝星狀細胞損傷的保護性作用

2.1.1 Cygb-siRNA篩選

用設計合成的3個siRNA序列轉染LX-2細胞48 h后提取總RNA行RT-PCR、72 h后提取總蛋白行Western blotting，結果如圖1所示，可見si1轉染后能明顯減少Cygb基因的表達，si2效果不明顯，因此本實驗中應用si1。

2.1.2 siRNA干擾Cygb后LX-2細胞對氧化損傷的反應

如圖2所示，100 μmol/L過氧化氫作用于NC轉染的 LX-2細胞 1 d未對細胞增殖產生影響，而Cygb被干擾的細胞增殖率顯著降低 (P＜0.01)，顯然Cygb被干擾使LX-2對過氧化氫的毒性更加敏感了；繼續延長作用時間，過氧化氫對細胞的毒性作用也逐漸明顯，且對于Cygb被干擾的細胞毒性要顯著大于轉染對照RNA的細胞組 (P＜0.01)，說明肝星狀細胞內源性的 Cygb在過氧化氫造成的氧化環境中對細胞具有顯著的保護性作用；同樣，無論是單用 50 μmol/L Fe-NTA 作用或是 50 μmol/L Fe-NTA+20 μmol/L AA協同作用，Cygb被干擾的細胞均比轉染對照siRNA的細胞更易產生損傷，證實內源性Cygb在Fe-NTA/AA造成氧化環境中對肝星狀細胞同樣具有顯著的保護性作用。

圖1 Cygb-siRNA的篩選Fig. 1 Screening of Cygb-siRNA. (A) RT-PCR. (B) Western blotting. (C) Quantification of the expression of cygb mRNA and protein, respectively.

圖2 siRNA干擾Cygb后氧化反應對LX-2細胞增殖的影響Fig. 2 Effects of oxidation on the proliferation of LX-2 cells transfected with siRNA targeting Cygb. (A) H2O2 treated. (B) Fe-NTA/AA treated. *P<0.05; **P<0.01.

2.2 重組 Cygb蛋白對氧化反應引起的肝星狀細胞損傷的保護性作用

2.2.1 H2O2損傷

經Cygb蛋白預處理后再加入200 μmol/L H2O2作用48 h，進行MTT檢測結果如圖3所示。過氧化氫對rHSC及LX-2細胞均表現出明顯的毒性；加入50 μmol/L VE、高濃度Cygb蛋白、低濃度Cygb蛋白預處理都能對過氧化氫造成的細胞損傷起到一定的保護作用，其中50 mg/L Cygb蛋白起到的保護作用最明顯 (P＜0.01)，能完全抵消 200 μmol/L過氧化氫對LX-2細胞的作用 (圖3B，與未經過氧化氫處理的對照組相比較P＞0.05)。

2.2.2 Fe-NTA/AA損傷

圖3 Cygb蛋白對H2O2損傷的保護性作用Fig. 3 Protection effects of Cygb protein towards the injury induced by H2O2. (A) rHSC. (B) LX-2. VE: 50 μmol/L; Cygb-H: 50 mg/L; Cygb-L: 10 mg/L. **P<0.01.

圖4 Cygb蛋白對Fe-NTA/AA損傷的保護性作用Fig. 4 Protection effects of Cygb protein towards the injury induced by Fe-NTA/AA. (A,B) rHSC. (C) LX-2. *P<0.05; **P<0.01.

加入 50 mg/L Cygb蛋白預處理能夠抑制100 μmol/L Fe-NTA引起的rHSC增殖 (圖4A，作用1 d P＜0.01；作用2 d P＜0.05)；在1 000 μmol/L Fe-NTA與AA共同作用的情況下，Cygb蛋白預處理同樣能夠減小由 Fe與 AA引起的協同增效作用(圖4B，作用2 d&3 d P＜0.01)。因此，在Fe-NTA/AA作用下，Cygb蛋白能夠起到抑制rHSC細胞過度增殖以及保護其被過度損傷的作用。對于LX-2細胞，50 mg/L Cygb蛋白預處理組細胞增殖率顯著高于單用500 μmol/L Fe-NTA處理組 (P＜0.05)，且能極顯著降低500 μmol/L Fe-NTA+20 μmol/L AA對LX-2造成的毒性作用 (P＜0.01)。

圖5 Cygb蛋白對氧化反應引起的LX-2細胞損傷的治療性作用Fig. 5 Therapeutic effects of Cygb protein on LX-2 cells towards the injury induced by oxidation. (A) H2O2 treated. (B) Fe-NTA/AA treated. VE: 50 μmol/L; Cygb-H: 50 mg/L; Cygb-L: 10 mg/L. *P<0.05; **P<0.01.

2.3 重組 Cygb蛋白對氧化反應引起的肝星狀細胞損傷的治療性作用

加入 200 μmol/L H2O2作用 30 min后再加入Cygb蛋白處理，48 h后進行MTT檢測結果如圖5所示。過氧化氫對LX-2細胞表現出明顯的毒性，抑制率約25%；加入50 μmol/L VE、高濃度Cygb蛋白、低濃度Cygb蛋白的各組細胞相對增殖率與單加過氧化氫的陽性對照組相比未表現出顯著性差異(圖5A，P＞0.05)，說明Cygb蛋白或是VE之類的抗氧化劑對過氧化氫造成的細胞損傷沒有顯著的治療性作用。然而Fe-NTA作用30 min后加入50 mg/L Cygb蛋白處理的LX-2細胞增殖率卻顯著高于單用500 μmol/L Fe-NTA處理組 (圖5B，P＜0.05)，且能顯著降低 500 μmol/L Fe-NTA+20 μmol/L AA對LX-2造成的毒性作用 (圖5B，P＜0.01)。

2.4 Cygb蛋白對于氧化反應引起的肝星狀細胞內超氧化物水平的影響

2.4.1 H2O2處理

加入500 μmol/L過氧化氫作用后會引起rHSC及LX-2細胞內超氧化物顯著增多 (圖6A2、B2)，而加入 Cygb蛋白預處理的細胞內超氧化物含量明顯降低，高濃度組 (圖 6A4、B4) 熒光強度明顯弱于低濃度組 (圖6A3、B3)，與對照組相差無幾 (圖6A1、B1)，說明 Cygb蛋白預處理可顯著減少由過氧化氫引起的肝星狀細胞內超氧化物的增加。

2.4.2 Fe-NTA處理

加入500 μmol/L Fe-NTA作用后會引起rHSC及LX-2細胞內超氧化物顯著增多 (圖7A2、B2)，而加入 Cygb蛋白預處理的兩種細胞內超氧化物含量都明顯降低 (圖7A3，A4，B3，B4)，證明Cygb蛋白預處理可顯著減少由 Fe-NTA引起的細胞內超氧化物的增加。

圖6 細胞內超氧化物檢測Fig. 6 Intracellular superoxide assay. The red fluorescence represented the superoxide in the cells. (A) rHSC. (B) LX-2. 1?4: control, H2O2 group, 10 mg/L Cygb group and 50 mg/L Cygb group, respectively.

圖7 細胞內超氧化物檢測Fig. 7 Intracellular superoxide assay. The red fluorescence represented the superoxide in the cells. (A) rHSC. (B) LX-2. 1?4: control, Fe-NTA group, 10 mg/L Cygb group and 50 mg/L Cygb group, respectively.

2.5 細胞內過表達 Cygb蛋白對氧化反應引起的肝星狀細胞損傷的保護性作用

如圖8所示，無論是單用500 μmol/L Fe-NTA處理，或是Fe-NTA+20 μmol/L AA協同作用24 h后，轉染pCygb的LX-2細胞增殖率均要顯著高于轉染pEGFP的細胞組 (圖8，Fe-NTA/AA model)；同樣，用400 μmol/L過氧化氫處理24 h后，轉染pCygb的細胞增殖率要明顯高于轉染pEGFP的細胞組 (圖 8，H2O2model)，說明 LX-2細胞內過表達Cygb蛋白會對氧化損傷造成的毒性作用起到保護性作用。

圖8 LX-2細胞內過表達Cygb蛋白對氧化損傷的保護性作用Fig. 8 Effects of oxidation on the proliferation of LX-2 cells over-expressing Cygb gene. *P<0.05; **P<0.01.

3 討論

本文選取了兩種肝臟中有代表性的氧化模型：過氧化氫模型及鐵過載模型，研究了Cygb蛋白在肝纖維化氧化應激中發揮的具體作用。結果表明內源性 Cygb蛋白對于兩種氧化反應導致的肝星狀細胞損傷都具有顯著性的保護作用，證明其在活化肝星狀細胞內的表達上調是其應對氧化應激的保護性措施，而并非只是纖維化的標志分子。利用重組Cygb蛋白的實驗則進一步證實了 Cygb蛋白對人肝星狀細胞系 LX-2及原代大鼠肝星狀細胞都能發揮顯著的保護作用，且對于鐵過載導致的肝星狀細胞損傷還具有顯著的治療性作用。

為何預處理時Cygb蛋白及VE均能表現出明顯的保護作用，而過氧化氫作用30 min后處理卻效果不佳呢？目前多項研究已經證實Cygb作為一種胞漿蛋白在細胞內發揮作用，而并非一種分泌性蛋白[13-15]，并且尚無相關細胞表面 Cygb受體的報道出現，因此Cygb蛋白進出細胞尚缺乏相應的主動運輸機制。由文獻[16]可知過氧化氫較易從溶液中擴散穿透細胞膜進入細胞中。若先用過氧化氫處理細胞半小時，則大部分過氧化氫已經透過細胞膜進入細胞中發揮作用，而Cygb蛋白則由于缺乏細胞表面受體或其他的主動運輸機制而較難被細胞吸收而在胞內發揮作用；若先用Cygb蛋白進行預處理，則由于Cygb具有顯著的過氧化物酶活性，加入的過氧化氫會首先與溶液中的Cygb蛋白相互作用，大大降低實際對細胞發揮作用的過氧化氫的濃度，因而會對細胞產生顯著保護作用，從理論上講，只要溶液中的Cygb蛋白能夠完全反應掉加入的過氧化氫，則可完全抵消過氧化氫產生的毒性。而在鐵過載模型中，Cygb蛋白卻能對肝星狀細胞發揮顯著的保護性作用，這是由于肝星狀細胞表面不具備鐵吸收受體而導致大部分Fe游離于胞外，因而同樣在胞外的Cygb蛋白可較充分發揮其抗氧化作用。簡而言之，重組Cygb蛋白對胞內的活性氧清除效果不理想，可能與其進出細胞缺乏相應的主動運輸機制有關。由此推論，通過將Cygb基因導入細胞中使其在細胞內過量表達或者通過基因工程手段在 Cygb蛋白上連接小分子穿膜肽[17]，使其能夠穿過細胞膜進入胞內發揮作用，可能是實現 Cygb蛋白直接應用于肝纖維化治療的解決方案。在此前提下，本實驗進一步利用脂質體將 Cygb質粒轉染入肝星狀細胞中使其過表達，證實細胞內過表達Cygb蛋白對無論是鐵過載或是過氧化氫引起的氧化反應均能發揮較好的保護性作用。

由課題組前期研究可知過氧化氫與Fe-NTA/AA的氧化作用機制不同，Fe-NTA/AA所引發的脂質過氧化反應較過氧化氫要溫和，因而對完全活化的LX-2細胞及未完全活化的rHSC產生截然不同的作用[11]。本文的實驗證實重組 Cygb蛋白不僅能保護完全活化的LX-2細胞免受氧化應激損傷，并且能發揮抑制未完全活化的原代肝星狀細胞過度增殖以及保護其被過度損傷的作用，提示該蛋白在肝纖維化進展的不同階段都能發揮抗氧化治療作用。

本文為全面闡釋Cygb的抗氧化作用及機制、加速藥物新靶點開發提供了理論依據。

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