蔗糖轉運蛋白基因VvSUC11和VvSUC12雙價植物表達載體的構建及在甜菜中的遺傳轉化

殷東林，祝建波，王愛英，向本春

石河子大學農業生物技術重點實驗室，石河子 832000

蔗糖是植物光合作用同化產物最主要的轉運形式，其轉運的方向和速率對于高等植物的生長發育至關重要[1]。蔗糖由源向庫的運輸是通過韌皮部進行的。光合同化物進出韌皮部篩管分子是通過兩種不同模式轉運的，即共質體途徑和質外體途徑[2]。其中蔗糖運輸的質外體途徑在許多農作物中占有重要的地位。在質外體途徑中，蔗糖主動越膜裝載入韌皮部進行運輸，然后在庫端越膜卸載進入庫器官細胞。蔗糖的跨膜運輸及其在植物中的分配需要依賴于膜上的蔗糖轉運蛋白 (Sucrose/H+cotransporters或sucrose transporters，SUCs或SUTs)，因此蔗糖轉運蛋白在蔗糖轉運過程中起著極為重要的作用[3-4]。

在高等植物中，自1992年Riesmeier等[5]從菠菜Spinacia oleracea L.中克隆得到第一個蔗糖轉運蛋白以來，許多蔗糖轉運蛋白相繼從不同植物以及不同器官克隆得到[6]。Davies等[7]于1999年從葡萄V. vinifera果實中克隆得到了3個預測為葡萄蔗糖轉運蛋白的基因 (VvSUC11、VvSUC12、VvSUC27)，其中2個 (VvSUC11、VvSUC12) 在酵母中得到了功能驗證[8]。VvSUC11和VvSUC12在葡萄果實中具有相似的表達模式，在果實成熟的過程中表達量增高，二者的主要功能被認為是負責蔗糖從質外體(Apoplast) 向薄壁細胞 (Parenchyma cell) 裝載[8]；而VvSUC27的表達與前兩者有顯著不同，在果實成熟過程中表達量降低[7]。VvSUC12和VvSUC27在葡萄胚性和非胚性愈傷組織中的表達也有差異[9]。最近VvSUC27的功能也在酵母中得到了驗證[10]。

雖然這 3種蔗糖轉運蛋白的功能在酵母中得到了驗證，并且發現轉基因酵母提高了積累蔗糖的能力、糖轉運蛋白在酵母中的表達有助于蔗糖的跨膜運輸及糖轉運功能的促進與溫度和 pH有很大的關系[8,10]，但這3種蔗糖轉運蛋白在植物中的功能驗證方面卻鮮有報道。

蔗糖通過韌皮部從源到庫的運輸被廣泛報道[1,3]。蔗糖從源組織運輸和裝載到韌皮部中的過程已經研究很詳細了，而蔗糖從韌皮部卸載到諸如根、種子和塊莖等庫組織的過程研究的不夠深入。對蔗糖進入果實即一些植物主要庫器官的機制了解還很少。

基于上述原因，本研究根據蔗糖轉運蛋白在糖分積累中的作用，從調控源、庫關系的角度出發，利用分子生物學手段，構建含有甘薯的甘薯貯藏蛋白基因根部特異性啟動子的植物表達載體pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12，把蔗糖轉運蛋白基因VvSUC11和VvSUC12轉化到甜菜中驗證其在植物中的功能和探索蔗糖在甜菜塊根中可能的運輸機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌種

原核表達載體pGM-T-SP1、pGM-T-VvSUC11、pGM-T-VvSUC12，以及植物表達載體 pBI121-SP2-GUS均由本實驗室構建并保存，植物表達載體pCAMBIA2301，以及大腸桿菌 Escherichia coli DH5α、根癌農桿菌Agrobacterium tumefaciens菌株GV3101均為本實驗室保存。

1.1.2 生化試劑

Taq DNA聚合酶、限制性內切酶XbaⅠ、SacⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、DraⅢ、T4 DNA連接酶、反轉錄試劑盒RNA PCR Kit (AMV) 均購于上海生物工程公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自 Promega公司(美國)；總RNA提取試劑盒、DNA marker購自北京Tiangen公司；其他試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.1.3 植物材料

甜菜B. vulgaris KWS-9103品種的種子由石河子甜菜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 雙價植物表達載體 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12的構建

本實驗室已從葡萄中克隆出蔗糖轉運蛋白基因VvSUC11和VvSUC12，從甘薯中克隆出甘薯貯藏蛋白 (Sporamin) 基因的根部特異性啟動子[11]，本文中命名為SP1和SP2。為了構建這個雙價載體需要構建3個中間表達載體。

1) pCAMBIA2301-SP1載體的構建：啟動子SP1左右兩端的酶切位點分別為Hind Ⅲ和Dra Ⅲ(表 1)。用 HindⅢ/DraⅢ在 37 ℃下分別雙酶切pCAMBIA2301和pGM-T-SP1載體，回收大片段和小片段，大、小片段在 T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α，挑單克隆，用SP1的引物 (表1) 進行菌液PCR鑒定。對陽性菌液提取質粒用HindⅢ/DraⅢ雙酶切鑒定正確后命名為pCAMBIA2301-SP1。同時陽性克隆的菌種和質粒于?70 ℃保存備用。

2) pCAMBIA2301-SP2-GUS-SP1載體的構建：啟動子SP2與啟動子SP1的區別僅在于右端酶切位點不同，啟動子SP2左右兩端的酶切位點是HindⅢ和XbaⅠ (表1)。用HindⅢ/EcoRⅠ在37 ℃下雙酶切載體 pCAMBIA2301-SP1多克隆位點，回收大片段，同時用 HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切載體 pBI121-SP2-GUS，回收小片段得到表達框SP2-GUS-NOS，將表達框插入到載體 pCAMBIA2301-SP1多克隆位點，轉化大腸桿菌 DH5α，挑單克隆，用 GUS的引物 (表1) 進行菌液PCR鑒定。對陽性菌液提取質粒用 HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切鑒定正確后命名為pCAMBIA2301-SP2-GUS-SP1。同時陽性克隆的菌種和質粒于?70 ℃保存備用。

3) pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1載體的構建：基因GUS和VvSUC12左右兩端的酶切位點都是XbaⅠ和SacⅠ (表1)。用XbaⅠ/SacⅠ雙酶切上面的載體pCAMBIA2301-SP2-GUS -SP1，回收大片段。Xba I/Sac I雙酶切pGM-T-VvSUC12載體，回收小片段。小片段與大片段在T4 DNA連接酶的作用下連接過夜，轉化DH5α，挑單克隆，用基因VvSUC12的引物 (表 1) 菌液 PCR鑒定。對陽性菌液提取質粒用 XbaⅠ/SacⅠ雙酶切鑒定正確后命名為pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1。陽性克隆的菌種和質粒于?70 ℃保存備用。

表1 研究中使用的引物序列Table 1 Sequences of oligonucleotide primers used in this study

4) pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12載體的構建：基因VvSUC11左右兩端的酶切位點都是Dra Ⅲ，但兩端的序列并不完全相同，右端酶切位點的序列與啟動子 SP1右端酶切位點的序列相同，左端的與它們不同 (表 1)，這樣不會出現反向連接。用 Dra Ⅲ單酶切 pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1載體，回收大片段，然后去磷酸化，同時用Dra Ⅲ單酶切pGM-T-VvSUC11載體，回收小片段與大片段在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過夜，轉化大腸桿菌 DH5α，挑單克隆，用基因VvSUC11引物 (表1) 菌液PCR鑒定。對陽性菌液提取質粒用 Dra Ⅲ單酶切鑒定正確后命名為pCAMBIA2301- SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12。同樣，陽性克隆的菌種和質粒于?70 ℃保存備用。

1.2.2 雙價植物表達載體用凍融法轉化根癌農桿菌GV3101

農桿菌 GV3101感受態的制備及轉化，參考本實驗室的方法[11]，并使用基因VvSUC11的引物 (表1) 進行菌液PCR檢測。

1.2.3 農桿菌介導法轉化甜菜

1) 外植體的制備：將甜菜KWS-9103品種的種子用自來水浸泡1 h，在超凈工作臺中轉移到滅過菌的三角瓶中，先用10%的H2O2處理3 min，然后用0.1%的升汞處理8 min，再用無菌水漂洗5~6次。將消過毒的種子接種于含瓊脂 0.7%、蔗糖 3%的1/2 MS (pH 5.8) 基本培養基上，在24 ℃±2 ℃下暗培養，使種子萌發。取發芽10 d左右的小苗，剪掉根部，轉移至預培養培養基 (Pre-culture medium) (表2) 中進行預培養50~60 d后剪甜菜的葉柄1 cm左右做外植體。甜菜的葉柄在預培養培養基 (表 2)中再預培養2、4、6 d。

2) 農桿菌的培養：取保存的含有目的基因的菌種GV3101在含有50 mg/L卡那霉素 (Kan)、40 mg/L利福平 (Rif) 和50 mg/L慶大霉素的LB固體培養基上劃線，28 ℃培養2 d。從平板上挑取單菌落接入10 mL含有50 mg/L Kan、40 mg/L Rif和50 mg/L慶大霉素的LB液體培養基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養過夜。吸取2 mL農桿菌菌液，轉入100 mL含有50 mg/L Kan、40 mg/L Rif和50 mg/L慶大霉素的LB液體培養基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養4~5 h，直到菌液濃度OD600為0.6~0.7，將菌液4 ℃、4 000 r/min離心8 min，收集菌體，并將菌體重懸于已加入0、0.005%、0.01%的表面活性劑Silwet L-77的重懸培養基 (Suspension medium) (表2) 中，使重懸培養基 (表2) 的OD600為0.3、0.5、0.7、0.9。

3) 甜菜轉化：將預培養的葉柄浸泡到農桿菌的重懸培養基 (表2) 中，搖蕩10 min后棄掉菌液；用無菌濾紙吸干表面菌液后，將葉柄接種于鋪有濾紙的共培養培養基 (Co-cultivation medium) (表2)中，暗培養3 d。

4) 延遲篩選、選擇培養及植株再生：將共培養后的葉柄轉接到延遲篩選培養基 (Delay-screening medium) (表2) 中，培養0 d、2 d、4 d、6 d。然后，轉接到選擇培養基 (Selection medium) (表2) 中進行選擇培養，每隔15 d左右更換一次培養基。待抗卡那霉素甜菜再生芽長至2~3 cm時，切下放入生根培養基 (Root-induction medium) (表2) 中，誘導生根。

1.2.4 轉基因甜菜的PCR及RT-PCR檢測

待轉化的甜菜生根后，采用CTAB法提取甜菜葉片基因組 DNA。通過PCR擴增來檢測目的基因是否整合到甜菜基因組中。用Trizol法提取PCR陽性植株RNA，按照Tiangen公司的Trizol試劑說明書進行。首先反轉錄合成 cDNA，然后以此為模板進行PCR來檢測目的基因是否表達。

表2 甜菜轉化和再生培養基Table 2 Media used in transformation and regeneration of sugar beet

2 結果與分析

2.1 雙價植物表達載體 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12的構建和鑒定

2.1.1 pCAMBIA2301-SP1載體的構建和鑒定

用 HindⅢ/DraⅢ雙酶切重組質粒pCAMBIA2301-SP1，得到預期大小 (365 bp) 的片段 (圖1A)。

2.1.2 pCAMBIA2301-SP2-GUS-SP1載體的構建和鑒定

用 HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切重組質粒pCAMBIA2301-SP2-GUS-SP1，得到預期大小 (約2.2 kb) 的片段 (圖1B)。

2.1.3 pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1載體的構建和鑒定

重組質粒pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1用XbaⅠ/SacⅠ雙酶切鑒定，得到1 850 bp大小的片段(圖1C)，與目標片段一致。

2.1.4 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12載體的構建和鑒定

重組質粒 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12用Dra Ⅲ單酶切鑒定，得到1 547 bp大小的片段 (圖1D)，與目標片段一致。

2.2 雙價植物表達載體轉化根癌農桿菌和 PCR鑒定

將 質 粒 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12轉化制備好的根癌農桿菌GV3101感受態細胞，在固體培養基 (LB+50 mg/L Kan+40 mg/L Rif+50 mg/L慶大霉素) 上篩選轉化子。隨機挑取不同單菌落接種于加有50 mg/L Kan、40 mg/L Rif和50 mg/L慶大霉素的LB液體培養基中，28 ℃，200 r/min培養大約48 h，使用基因VvSUC11的引物進行菌液PCR鑒定，得到預期1 547 bp的片段(圖2)。

2.3 雙價植物表達載體轉化甜菜和甜菜遺傳轉化體系的建立

2.3.1 外植體預培養時間對抗性芽分化頻率的影響

圖1 雙價植物表達載體pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12的構建和鑒定Fig. 1 Construction and identification of the bivalent plant expression vector pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12. (A) 1: pCAMBIA2301-SP1 is digested by Hind Ⅲ/Dra Ⅲ to get the 365 bp SP1 fragment; 2: recombined plasmid pCAMBIA2301-SP1; M: marker Ⅲ . (B) M:marker Ⅲ; 1: pCAMBIA2301-SP2-GUS-SP1 is digested by Hind Ⅲ/EcoR Ⅰto get about 2.2 kb SP2-GUS-NOS fragment. (C) 1: pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1 is digested by Xba I/Sac I to get the 1 850 bp VvSUC12 fragment; 2: recombined plasmid pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1; M: marker Ⅲ . (D) 1: pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12 is digested by Dra Ⅲ to get the 1 547 bpVvSUC11 fragment; M: marker Ⅲ.

圖2 雙價植物表達載體轉化根癌農桿菌的PCR鑒定Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pCAMBIA2301- SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12 in A. tumefaciens strains GV3101 by PCR. M: marker Ⅲ; 1–7: Results of PCR of single-colony of A. tumefaciens strains GV3101 transformed by recombinant plasmid pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12; 8: PCR product of recombined plasmid pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12; 9: negative control.

取甜菜的葉柄約1 cm作外植體，在Pre-culture medium (表2) 中預培養2、4、6 d，進行遺傳轉化研究。預培養時間對抗性芽分化率有很大的影響，預培養4 d抗性芽分化率最高，可達37%。預培養過短或過長都會大大降低轉化率 (圖 3)。預培養過短侵染后外植體褐化嚴重，這可能是由于傷口尚未愈合的外植體對農桿菌比較敏感，恢復農桿菌對其的傷害能力較弱，在篩選培養基中褐化比較嚴重；預培養過長 (大于6 d) 抗性芽的分化頻率降低，是因為部分外植體在侵染前已分化產生不定芽，這些不定芽在以后的選擇培養中逐漸褐化死亡。

圖3 預培養時間對轉化效率的影響Fig. 3 Effect of pre-culture time on transformation efficiency.

2.3.2 農桿菌重懸液的濃度對抗性芽分化頻率的影響

不同的外植體材料對根癌農桿菌的敏感性不同，為了確定最佳的侵染濃度，將預培養后的甜菜葉柄置于不同濃度的農桿菌重懸液中進行侵染。由圖4可知，農桿菌重懸液濃度OD600為0.5時，侵染效果最佳，抗性芽分化率最高。菌液濃度 OD600高于 0.7時，外植體褐化加重，可能是因為高濃度的菌液對葉柄細胞有毒害作用。同時菌液濃度過高暗培養后農桿菌不易抑制，污染較重。

圖4 農桿菌重懸液濃度對抗性芽分化頻率的影響Fig. 4 Effect of concentrations of Agrobacterium suspension on resistant buds rates.

2.3.3 表面活性劑Silwet L-77的濃度對抗性芽分化頻率的影響

表面活性劑Silwet L-77可以降低菌液的表面張力，增加菌液與外植體的接觸面積，從而促進轉化。但表面活性劑濃度過大對外植體有一定的傷害，所以要確定最適宜的濃度。為此，侵染前在農桿菌重懸液中加了0、0.005%、0.01%的表面活性劑Silwet L-77進行試驗。由圖5可知，當表面活性劑Silwet L-77的濃度為0.005%時葉柄的褐化率最低，抗性芽的分化頻率最高，可達39%。

2.3.4 延遲篩選時間對對抗性芽分化頻率的影響

共培養后的葉柄如果立刻進行篩選，則抗性芽的分化率比較低 (圖 6)，如果適當在 Delayscreening medium (表2) 中，培養一段時間會大大增加轉化率。延遲篩選4 d，抗性芽的分化率最高，可達42%。延遲篩選時間大于4 d時，抗性芽也隨之降低 (圖6)。

2.3.5 轉化甜菜的再生

圖5 表面活性劑Silwet L-77的濃度對轉化效率的影響Fig. 5 Effect of concentrations of surfactant Silwet L-77on transformation efficiency.

圖6 延遲篩選時間對抗性芽分化頻率的影響Fig. 6 Effect of delay-screening time on resistant buds rates.

甜菜葉柄預培養4 d (圖7A)，在OD600為0.5的含有 0.005% Silwet L-77的農桿菌 Suspension medium中侵染10 min；轉入Co-cultivation medium中培養3 d，轉入Delay-screening medium中培養4 d；移入Selection medium中選擇培養30 d，得到抗性芽 (圖7B)。待抗性芽長至2~3 cm時，切下放入Root-induction medium中生根 (圖7C、D)。

2.4 轉基因甜菜的PCR及RT-PCR檢測

2.4.1 轉基因植株的PCR檢測

取 6株轉化甜菜和 1株對照甜菜的葉片提DNA，分別用基因VvSUC11和VvSUC12的引物 (表1) 進行PCR檢測。有4株檢測到基因VvSUC11的活性 (圖8A)，有3株檢測到基因 VvSUC12活性 (圖8B)。PCR結果表明，在 6株轉化甜菜中有3株是VvSUC11和 VvSUC12共整合到甜菜基因組中 (圖9A、B)。

2.4.2 轉基因植株的RT-PCR檢測

以3株同時轉化了2個基因的甜菜植株為材料，用基因 VvSUC11和 VvSUC12引物 (表 1) 進行RT-PCR檢測。有 2株甜菜在根和莖中都檢測到VvSUC11和VvSUC12的活性 (圖9A、B)，這可能是因為一般情況下，甘薯的甘薯貯藏蛋白(Sporamin) 基因的根部特異性啟動子主要在塊根中起作用[12]，而在含蔗糖的培養基上生長的植物莖部也有其活性[13]。

圖7 轉化甜菜的再生Fig. 7 Regeneration of transformation sugar beet. (A) Pre-culture of petioles. (B) Regeneration of resistant buds. (C, D) Induced roots.

圖8 轉化甜菜的PCR檢測結果Fig. 8 Identification of transformed sugar beets by PCR. (A) M: marker Ⅲ ; 1?6: PCR results of transformed sug ar beets using the primers of VvSUC11; 7: PCR results of wild-type sugar beet using the primers of VvSUC11; 8: PCR results of plasmid carrying VvSUC11 using the primers of VvSUC11. (B) M: marker Ⅲ ; 1?6: PCR results of transformed sugar beets using the primers of VvSUC12; 7: PCR results of wild-type sugar beet using the primers of VvSUC12; 8: PCR results of plasmid carrying VvSUC12 using the primers of VvSUC12.

圖9 轉化甜菜的RT-PCR檢測結果Fig. 9 Identification of transformed sugar beets by RT-PCR. (A, B) M: marker Ⅲ ; 1?3: RT-PCR results of root, stem, leaf of the fist transformed sugar beet respectively using the primers of VvSUC11and VvSUC12; 4?6 : RT-PCR results of root, stem, leaf of the second transformed sugar beet respectively using the primers of VvSUC11and VvSUC12; 7?9: RT-PCR results of root, stem, leaf of the third transformed sugar respectively using the primers of VvSUC11and VvSUC12; 10: RT-PCR results of wild-type sugar beet respectively using the primers of VvSUC11and VvSUC12; 11: RT-PCR results of plasmid pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12 respectively using the primers of VvSUC11and VvSUC12.

3 討論

根據系統發生學的分析，所有已知的蔗糖轉運蛋白和蔗糖轉運蛋白類似蛋白可以分為 3個亞群：SUT1、SUT2和SUT4；VvSUC11屬于SUT4亞群，VvSUC12 屬于SUT2亞群[14]。SUT4亞群中的成員一般都具有低親和性/高轉運能力 (Low-affinityhigh-capacity，LAHC)[14]。盡管該類 SUT對蔗糖的親和力要弱一些，但在蔗糖濃度高時卻有助于大量蔗糖的轉運。它們主要參與高濃度蔗糖的轉運步驟，向庫組織大量轉運蔗糖，在決定庫容大小上起主要作用，還可能參與蔗糖吸收效率的調控[15]。SUT2亞族或為無蔗糖轉運能力、可能具有蔗糖信號感應(Sucrose sensing) 功能的類蔗糖載體蛋白[4]，或為低親和性/高轉運能力的蔗糖載體蛋白[16-17]。Manning等[8]研究表明，VvSUC11和VvSUC12在葡萄果漿中作用是負責蔗糖從質外體向薄壁細胞裝載。可見，VvSUC11和VvSUC12決定著葡萄漿果的糖含量。

植 物 SUC 屬 于 MFS (Major facilitator superfamily) 中的糖轉運家族的一個中等規模的亞家族[18]。屬于 MFS 的膜蛋白，通過寡聚化(Oligomerization) 而形成同源二聚體、異源二聚體、甚至四聚體等是一種非常普遍的現象，這可能是其調節自身轉運活性的一種方式[19]。根據不同蔗糖載體蛋白在植株中的分布和組織細胞定位、不同的動力學特征及表達調控模式等推測，寡聚化可能也是植物對其蔗糖載體轉運活性進行精確調控的一種主要方式[20]。Davies等[7]研究發現，VvSUC11 和VvSUC12在葡萄漿果中的表達模式一致，當己糖開始在液泡中積累的時候，VvSUC11和VvSUC12在漿果中的表達增加。這暗示了 VvSUC11和 VvSUC12在功能上可能存在著互作。基于這種考慮，本研究構建了含這兩個基因的雙價植物表達載體。

農業生產中，為了獲得高產，不僅要設法提高光合作用形成的生物學產量，而且要通過一定的措施來提高經濟學產量。本研究把甘薯的甘薯貯藏蛋白 (Sporamin) 基因的根部特異性啟動子構建到載體上用于啟動VvSUC11和VvSUC12基因的表達，就是根據蔗糖轉運蛋白在糖分積累中的作用，從調控源到庫關系的角度出發，來定向的提高甜菜的經濟學產量，為通過基因工程的方法來提高農作物的產量提供新的思路。

本研究成功構建了含有甘薯的甘薯貯藏蛋白基因根部特異性啟動子的植物表達載體 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12；并首次將VvSUC11和VvSUC12基因轉化到甜菜中使其表達，來研究其能否提高甜菜的含糖量，為利用蔗糖轉運蛋白來提高農作物的有效的經濟學產量奠定堅實理論和應用基礎。建立了高效的甜菜遺傳轉化體系，為通過基因工程的方法來改良甜菜的品質提供方便。

REFERENCES

[1] Kühn C, Barker L, Bürkle L, et al. Update on sucrose transport in higher plants. J Exp Bot, 1999, 50: 935?953.

[2] Buchanan BB, Gruissem W, Jones RL. Biochemistry & Molecular Biology of Plants. Rockville: American Society of Plant Physiologists, 2000: 748?776.

[3] Williams LE, Lemoine R, Sauer N. Sugar transporters in higher plants-a diversity of roles and complex regulation. Trends Plant Sci, 2000, 5(7): 283?290.

[4] Barker L, Kühn C, Weise A, et al. SUT2, a putative sucrose sensor in sieve elements.Plant Cell, 2000, 12(7): 1153?1164.

[5] Riesmeier JW, Willmitzer L, Frommer WB. Isolation and characterization of a sucrose carrier cDNA from spinach by functional expression in yeast. EMBO J, 1992, 11(13): 4705?4713.

[6] Lalonde S, Boles E, Hellmann H, et al. The dual function of sugar carriers: transport and sugar sensing. Plant Cell, 1999, 11(4): 707?726.

[7] Davies C, Wolf T, Robinson SP. Three putative sucrose transporters are differentially expressed in grapevine tissues. Plant Sci, 1999, 147(2): 93?100.

[8] Manning K, Davies C, Bowan HC, et a1. Functionalcharacterization of two ripening-related sucrose transporters from grape berries. Ann Bot, 2001, 87(1): 125?129.

[9] Chen S, Zeng L, Chen SW, et a1. Differentiated expression of VvSUC12 and VvSUC27 in embryogenic and nonembryogenic calli of Vitis vinifera L. Chin J Biotech, 2010, 26(4): 530?537.陳思, 曾磊, 陳尚武, 等. 蔗糖轉運蛋白基因 VvSUC12和VvSUC27在葡萄胚性和非胚性愈傷組織中的差異表達. 生物工程學報, 2010, 26(4): 530?537.

[10] Zhang YL, Meng QY, Zhu HL, et al. Functional characterization of a LAHC sucrose transporter isolated from grape berries in yeast. Plant Growth Regul, 2008, 54(1): 71?79.

[11] Zhang YW. Preliminary studies of sucrose transporter function in improving the yield of sugar of sugar beet [D]. Shihezi: Shihezi University, 2009.張彥偉. 蔗糖轉運蛋白基因在提高甜菜含糖量中的初步研究[D]. 石河子: 石河子大學, 2009.

[12] Hattori T, Nakamura K. Genes coding for the major tuberous root protein of sweet potato: identification of putative regulatory sequence in the 5’upstream region. Plant Mol Biol, 1988, 11(4): 417?426.

[13] Ohta S, Hattori T, Morikami A, et al. High-level expression of a sweet potato sporamin gene promoter: β-glucuroidase (GUS) fusion gene in the stems of transgenic tobacco plants is conferred by multiple cell type-specific regulatory elements. Mol Gen Genet, 1991, 225(3): 369?378.

[14] Kühn C, Hajirezaei MR, Fernie AR, et al. The sucrose transporter StSUT1 localizes to sieve elements in potato tuber phloem and influences tuber physiology and development. Plant Physiol, 2003, 131(1): 102?113.

[15] Weise A, Barker L, Kühn C, et al. A new subfamily of sucrose transporters, SUT4, with low affinity/high capacity is localized in enucleate sieve elements of plants. Plant Cell, 2000, 12(8): 1345?1355.

[16] Schulze W, Weise A, Frommer WB, et al. Function of the cytosolic N-terminus of sucrose transporter AtSUT2 in substrate affinity. FEBS Lett, 2000, 485(2/3): 189?194.

[17] Meyer S, Melzer M, Truernit E, et al. AtSUC3, a gene encoding a new Arabidopsis sucrose transporter, is expressed in cells adjacent to the vascular tissue and in a carpel cell layer. Plant J, 2000, 24(6): 869?882.

[18] Lemoine R. Sucrose transporters in plants: update on function and structure. BBA Biomembranes, 2000, 1465(1/2): 246?262.

[19] Veenhoff LM, Heuberger EHML, Poolman B. The lactose transport protein is a cooperative dimer with two sugar translocation pathways. EMBO J, 2001, 20(12): 3056?3062.

[20] Reinders A, Schulze W, Kühn C, et al. Protein-protein interactions between sucrose transporters of difierent affinities colocalized in the same enucleate sieve element. Plant Cell, 2002, 14(7): 1567?1577.