抑肽酶對實驗性慢性肝損傷肝組織纖維化影響的研究

王心童,王虹蛟,王 強,孟威宏,顏煒群

(1.吉林大學白求恩醫學院,吉林 長春 130021;2.長春解放軍第461醫院,吉林 長春 130021;3.沈陽軍區總醫院;4.吉林大學再生醫學科學研究所）

關于肝纖維化機制及防治研究,目前是國內外生物學、醫學研究的熱點之一[1-6]。本論文利用實驗鼠的四氯化碳(CCl4）慢性肝損傷模型,同時利用膠原纖維染色檢測方法觀察抑肽酶對實驗性慢性肝損傷大鼠肝組織纖維化改變的影響,并對其作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wister大鼠,雌雄兼用,由長春高新醫學動物研究中心提供,合格證號:醫動字第1055118。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠慢性CCl4肝損傷模型的建立 Wister大鼠,體重190-210 g,雌雄各半,由高新實驗動物中心供應。本實驗采用新鮮的花生油作為溶劑。將25%CCl4溶解于花生油中混勻。正常對照組僅皮下注射花生油5 ml/kg,其它各組大鼠首次給予CCl4原液5 ml/kg,以后每周2次25%CCl4液(花生油稀釋）5 ml/kg皮下注射。禁食,不禁水。

1.2.2 動物分組及給藥 (1）第1組為正常對照組:腹腔注射等量生理鹽水。(2）第2組為慢性肝傷損模型組:腹腔注射等量生理鹽水。(3）第3組為抑肽酶小劑量組:腹腔注射抑肽酶2萬KIU/kg。(4）第4組為抑肽酶中劑量組:腹腔注射抑肽酶4萬KIU/kg。(5）第5組為抑肽酶大劑量組:腹腔注射抑肽酶8萬KIU/kg。(6）第6組為促肝細胞生長素注射液組(陽性組）:腹腔注射促肝細胞生長素100 mg/kg。3-5組每天給予抑肽酶一次,連用4周,第6組每天給予促肝細胞生長素一次,連用4周。禁食,不禁水。

1.2.3 膠原纖維染色 末次給藥1小時后處死大鼠,取肝大葉相同部位的一小塊肝組織固定于10%福爾馬林,常規法制做組織切片,利用Masson氏染色法染色進行膠原纖維染色后,在光鏡下觀察肝細胞變性壞死程度、肝間質纖維增生程度。利用Olympus圖像分析軟件自動分析藍染膠原面積。

1.2.4 統計學處理 實驗數據以ˉx±s表示,各組之間數據比較均采用兩組資料秩和檢驗的方法。

2 結果

利用Masson氏染色法染色肝組織膠原纖維以評測肝組織纖維化程度。膠原纖維被染為藍色或綠色,其它細胞、組織以紅色著色為主。利用Olympus圖像分析軟件自動分析藍染膠原面積。空白對照組極少見著色的膠原纖維,僅在血管周圍可見少量藍染膠原纖維區域,相對膠原面積為(0.9±0.01）%。模型對照組膠原纖維增生明顯,穿插肝組織形成較為明顯的假小葉,膠原纖維總面積大,相對膠原面積為(27±3.12）%。抑肽酶小劑量組膠原纖維增生明顯,相對膠原面積為(25±3.81）%,同模型組相比無明顯減輕趨勢。抑肽酶中劑量組,膠原纖維增生以局部多見,較少相互交叉形成假小葉,相對膠原面積為(19±5.18）%,與模型組相比膠原面積顯著減少(P＜0.05）。抑肽酶大劑量組,膠原纖維增生較輕,匯管區及血管周圍可見輕度膠原纖維增生,無假小葉形成,相對膠原面積為(6±1.93）%,與模型組相比顯著降低(P＜0.05）。促肝細胞生長素組膠原纖維增生明顯,以匯管區居多,假小葉形成較少,相對膠原面積分別為(24±9.8）%。與模型組相比顯著降低(P＜0.05）。并且隨著抑肽酶劑量的增加,膠原纖維增生減輕。尤其以抑肽酶大劑量組效果最為明顯,優于促肝細胞生長素組。實驗結果顯示,抑肽酶能夠顯著抑制大鼠肝臟纖維化。

3 討論

肝纖維化的形成是一緩慢而復雜的過程,不論何種致病因素,其機制都是肝臟受到外界刺激后引起細胞因子的釋放,細胞因子-細胞-細胞外基質相互作用,使肝臟細胞外基質代謝紊亂,在狄氏間隙過沉積,繼之肝竇毛細血管化是形成肝纖維化的分子病理學基礎。最終使基質沉積于肝臟。TGF-β在肝纖維化中的作用:TGF-β是一組具有多種功能的蛋白多肽。在肝纖維化時它能刺激細胞Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、ⅩⅧ型等大多數膠原mRNA水平的提高或蛋白產物的增加,并有調節肝臟再生的能力。腫瘤壞死因子α(TNF-α）:在體外TNF-α可以促進成纖維細胞及星狀細胞的增殖與轉化。白細胞介素族(IL-1、6）:IL-1主要由單核巨噬細胞產生,它能刺激成纖維細胞和HSC產生膠原。IL-6有較強的促進HSC增殖的作用,使細胞外基質的合成總量增加,IL-6還能促進α-2巨球蛋白的表達,抑制膠原酶活性,導致肝內膠原沉積。活化的枯否細胞可產生氧自由基從而損傷肝細胞,肝細胞損傷可引起肝星狀細胞活化。肝細胞能產生多種細胞因子,如成纖維細胞因子、轉化生長因子α、白介素-1、6、8及單核巨噬細胞集落刺激因子等。肝細胞通過將無生物活性的物質代謝為致纖維化物質而發揮作用。

CCl4致慢性肝損傷的主要機制是CCl4在肝細胞內產生三氯甲基自由基,引起脂質過氧化以及直接的膜溶解作用,使肝細胞壞死。CCl4可經肝內微粒體酶活化生成自由基,通過脂質過氧化物作用損傷破壞肝細胞,致使血清ALT、AST水平顯著增高。肝功能受損后,肝細胞制造白蛋白(A）的能力降低,引起A/G比例下降。CCl4慢性肝損組大鼠,正常肝小葉結構破壞,有廣泛的脂肪變性、肝細胞壞死及不同程度的間質纖維增生。

本實驗模型對照組膠原纖維增生明顯,穿插肝組織形成較為明顯的假小葉,膠原纖維總面積大。促肝細胞生長素組膠原纖維增生明顯,以匯管區居多,假小葉形成較少。抑肽酶小劑量組膠原纖維增生明顯,同模型組相比無明顯減輕趨勢。抑肽酶中劑量組,膠原纖維增生以局部多見,較少相互交叉形成假小葉,與模型組相比膠原面積顯著減少。抑肽酶大劑量組,膠原纖維增生較輕,匯管區及血管周圍可見輕度膠原纖維增生,無假小葉形成。并且隨著抑肽酶劑量的增加,膠原纖維增生減輕。尤其以抑肽酶大劑量組效果最為明顯,優于促肝細胞生長素組。

抑肽酶是一種是廣譜的非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑,被廣泛用于體外循環的心血管手術和多種疾病的治療[7-15]。目前國內外對抑肽酶保護肝損害的研究主要集中在:實驗性大鼠肝缺血再灌注損傷、人的肝癌切除術和原位肝移植的保護作用機制的研究。但目前國內外尚未見到有關抑肽酶對實驗性慢性肝損傷大鼠肝組織纖維化改變方面的報道。本實驗通過利用膠原纖維染色檢測方法觀察,顯示抑肽酶對大鼠慢性CCl4肝損傷模型具有很好的保護性作用,明顯減輕慢性肝損傷的程度,抑制肝纖維化的發展。盡管其作用機制還不清楚,但從本實驗的結果可以認為是從減輕肝細胞的損傷及抑制肝纖維化的發展兩個方面對慢性肝損傷起到保護性作用的。

[1]Kaplowitz N.Mechanisms of liver cell injury[J].J Hepatol,2000,32(1 Suppl）:39.

[2]Patel T,Gores GJ.Apoptosis and hepatobiliary disease[J].Hepatology,1995,21(6）:1725.

[3]Scaffidi C,Fulda S,SrinivasanA,et al.Two CD95(APO-1/Fas）signaling pathways[J].EMBO J.1998,17(6）:1675.

[4]王虹蛟,張馨木,常淑芳,等.抑肽酶對小鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國實驗診斷學.2005,9(3）:420.

[5]孟威宏,王虹蛟,張馨木,等.口服抑肽酶對大鼠急性肝損傷的保護作用[J].吉林大學學報醫學版,2006,32(3）:370.

[6]王虹蛟,孟威宏,王強,等.抑肽酶對實驗性慢性肝損傷的保護作用[J].中國實驗診斷學,2008,12(1）:4.