抗癌藥物羥基喜樹堿對PC12細胞毒副作用的研究

胡洪華,宋海星,胡瀚丹

(1.成都醫學院檢驗醫學院,2.成都醫學院生物醫學系,四川 成都 610083)

羥基喜樹堿(H ydroxycamp tothecin,HCPT)是從我國特有的珙桐科植物喜樹中提取分離的天然生物堿。國內外近年來大量研究表明,喜樹堿能夠誘導乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、直腸癌等多種腫瘤細胞凋亡[17-21]。羥基喜樹堿通過選擇性抑制DNA拓撲異構酶Ⅰ(TopoⅠ)而具有廣譜抗腫瘤效應,目前在臨床上已廣泛用于胃癌、腸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤的治療[1-3]。

PC12細胞為大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株,在形態結構及功能方面均具有神經元的特征,且可傳代培養,類型較為單一,細胞特性穩定[6],已被作為一種良好的神經系統體外模型用于神經細胞分化、離子通道、受體等研究,也是檢測神經毒性最常用的細胞株,可用于多種神經系統疾病,如阿爾茨海默病、帕金森病等的研究[7]。

抗癌藥物的毒副作用一直是腫瘤治療中的一大難題,為探討抗癌藥物對神經系統的毒副作用,本研究選用具有神經內分泌細胞和神經元特性的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株(PC12細胞)和具有廣譜抗腫瘤作用的羥基喜樹堿(HCPT),研究了HCPT對PC12細胞的毒性作用及細胞毒副作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑

羥基喜樹堿為湖北黃石飛云藥業產品,嗜鉻細胞瘤細胞株PC12由本實驗室傳代培養。FACS Calibur flow cytometer激光流式細胞儀為美國BD公司產品,二氧化碳培養箱為美國Thermo公司產品,倒置顯微鏡為日本Olympus公司產品,熒光顯微鏡為日本Olym pus公司產品,ZS-2板式酶標儀由美國Bio-tek公司生產,電泳儀為美國Bio-rad公司產品,成像儀為美國BD公司產品,DMEM培養基為GIBCO公司產品,CCK-8試劑盒由碧云天生物技術研究所提供,無支原體新生牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 PC12細胞凍于液氮中,實驗時進行復蘇并培養于含體積分數為10%新生牛血清、100 U/m L青霉素、100 U/m L鏈霉素及2mmoL/L L-谷氨酰胺、pH值為7.2-7.4的DMEM培養液中(完全培養液),于37℃、5%CO2條件下培養,生長到80%左右用0.125%的胰蛋白酶消化、傳代,選取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 HCPT對PC12細胞的細胞毒作用 取對數生長期細胞,0.125%胰酶制成細胞懸液,重懸于含體積分數為10%新生牛血清的DM EM培養液(含100 U/m L青霉素、100 U/m L鏈霉素及2 mmoL/L L-谷氨酰胺)中,細胞以1×104個/m L的終濃度接種于96孔培養板,培養24 h后進行藥物處理,按設計要求分12個實驗組,每組設3個復孔,HCPT終濃度分別為20μmol/L、15μmol/L、10 μmol/L、5μmol/L、1μmol/L、0.5μmol/L、0.1 μmol/L、0.05μmol/L、0.01μmol/L、0.005μm ol/L、0.001μm ol/L、0.0005μmo l/L(HCPT用含10%新生牛血清DMEM培養液稀釋),對照組加入等量的DMEM培養基,空白組不做任何處理。加藥后繼續培養,每隔24 h觀察細胞形態變化。培養72 h后,實驗組、對照組、空白組分別每孔加入200 μl的空白培養基,靜置5 min,然后吸取培養基,每孔加入10μLCCK-8溶液和90μL空白培養基,37℃孵育3 h,酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)值。細胞活力=(A加藥-A空白)/(A未加藥-A空白)×100%。

1.2.3 吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)染色觀察細胞形態 收集正常培養和羥基喜樹堿處理后的細胞,PBS洗滌后,每95μL的PBS液加入5μL的AO/EB混合液(各自以100μg/m L濃度等體積混合),室溫靜置5m in。分別取50μL混合產物于載玻片上,蓋玻片封片,熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態。1.2.4 細胞DNA分析 不同濃度的HCPT處理細胞48 h后,收集細胞,用PBS離心洗滌,按照試劑盒說明書的操作步驟提取DNA,1.2%瓊脂糖凝膠電泳2 h后,紫外燈下觀察照相。

1.2.5 HCPT對PC12細胞凋亡和細胞周期的研究 根據細胞活力測定結果,選擇適當的HCPT濃度處理細胞。收集2×106個細胞,用PBS洗滌二次后,重懸于500μL的PBS中,加入4℃乙醇固定12 h以上,離心除去乙醇,用PBS重懸洗滌,離心去PBS,加入碘化丙啶(PI,Sigm a公司)染色,室溫避光20min,上流式細胞儀檢測DNA含量和細胞周期,資料用modfit軟件分析。

1.3 統計學分析

兩樣本均數間的比較采用方差分析和t檢驗,率的比較用χ2檢驗,所有數據用SPSS 13.0分析,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 形態學觀察

倒置光學顯微鏡下觀察：對照組PC12細胞變多達到85%左右,細胞均貼壁生長,呈長梭形,細胞質均勻而透明,胞體近中央處可見圓形或橢圓形的細胞核;1μmol/L的HCPT濃度組細胞停止生長,細胞高度固縮,細胞核固縮,核碎裂,細胞膜完整,可見膜發泡成芽形成凋亡小體(見圖1)。

應用1μmol/L HCPT處理PC12細胞24 h后,AO/EB雙染于熒光顯微鏡下可見：正常細胞為綠色;早期凋亡細胞為淡綠色;凋亡晚期的細胞為桔紅色、綠色相間;死亡細胞為紅色(見圖2)。

2.2 HCPT對PC12細胞的細胞毒作用

各濃度的HCPT對PC12細胞皆有一定的增殖抑制作用,且隨著藥物作用濃度的升高,增殖抑制率逐漸升高(見圖3)。當HCPT的濃度在0.01μm ol/l以下時對PC12細胞的生長影響不大,作用48 h后細胞活力在90%以上;當HCPT的濃度在0.05 μmol/l～0.5μmol/l范圍內時,隨著HCPT濃度增加,PC12細胞的細胞活力從87.80%降到了8.03%;但當HCPT濃度繼續升高,細胞活力的下降不明顯。

2.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析

HCPT處理PC12細胞36 h后,瓊脂糖凝膠電泳顯示空白組為單一的DNA條帶;不同濃度的實驗組都可見片狀模糊條帶,梯狀DNA條帶不明顯;且當濃度為0.1μmo l/l時DNA片段化最為嚴重(見圖4)。

圖4 DNA凝膠電泳分析Fig.4 DNA gel electrophoresis

2.4 HCPT對PC12細胞凋亡和細胞周期的影響

1μm ol/l的HCPT對PC12細胞有明顯抑制生長的作用。在流式細胞圖上可看到細胞周期分布明顯變化(見表1和圖5),隨著藥物作用時間的延長,G0/G1期細胞、S期細胞逐漸減少,而G2/M期細胞和凋亡率逐漸增加。

表1 1μmol/l的HCPT處理PC12細胞后對細胞周期和凋亡的影響Tab.1 The influence of 1μmol/l HCPT on cell cycle and apoptosisof PC12 cell

3 討論

導致黑素瘤高死亡率的原因是凋亡相關信號的缺失和對化療的耐受[22],研究開發新的抗癌藥物和研究現成抗癌藥物的抗癌活性及抗癌機制十分必要。HCPT是DNA拓撲異構酶I(Topo-I)特異性抑制劑,其在體內可導致雙鏈DNA斷裂,從而控制DNA復制,阻斷RNA合成,干擾細胞分裂周期[8],所以HCPT被廣泛應用于臨床抗腫瘤治療中。有研究報道,HCPT的抗腫瘤作用是通過誘導S期細胞發生凋亡[9],但其誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制及其信號轉導途徑尚不清楚[10,11]。而細胞凋亡與細胞周期有密切的關系,有研究表明細胞凋亡存在著周期特異性,表現為不同因素誘導的凋亡發生在細胞的不同周期時段[12]。而HCPT在抗腫瘤的同時,必定對機體各個系統的正常細胞都有不同程度的影響。神經系統是人體內起主導作用的功能調節系統,體內各器官、系統的功能和各種生理過程都不是各自孤立地進行,而是在神經系統的直接或間接調節控制下,互相聯系、相互影響、密切配合,實現和維持正常的生命活動,故HCPT對神經細胞的毒副作用廣泛,應受到研究者的重視。

圖5 1μmol/l的HCPT處理PC12細胞后的流式細胞結果Fig.5 Flow cytometry test resu lts of PC12 cell after treatment with 1μmol/l HCPT

本研究通過光鏡從形態學觀察HCPT對PC12細胞的毒副作用,發現實驗組細胞出現細胞數量明顯減少,細胞體積縮小、核濃縮等變化,且隨著作用濃度的增加,上述改變愈加顯著,因此推測HCPT對PC12細胞的毒副作用除了抑制細胞增殖外還可能誘導了其凋亡。HCPT對PC12細胞增殖的影響結果表明,高濃度的HCPT抑制細胞生長明顯,可能使細胞死亡,低濃度的HCPT抑制細胞生長的作用不明顯。研究發現當HCPT的濃度在0.01 μmol/l以下時對PC12細胞的生長影響不大,將這段濃度區域稱為HCPT對PC12低濃度耐受期。而當HCPT的濃度從0.05μm ol/l增加到0.5μm ol/l,隨著HCPT濃度的增加PC12細胞的細胞活力從87.80%降到了8.03%,可見在這個濃度范圍內細胞的毒副作用與HCPT的濃度有非常密切的關系,我們將這段濃度區域稱為HCPT對PC12的效量驟變區。而當HCPT的濃度繼續升高,細胞活力的變化也不明顯,在這個濃度區域的HCPT對細胞有明顯的致死效應,此結果與張一等[13]用HCPT作用BRA-3A細胞的生長抑制曲線一致,把這段濃度區域稱為HCPT對PC12細胞的高濃度致死區。HCPT的濃度與PC12細胞活力的關系在指導臨床HCPT的用量上有指導意義,抗癌藥物HCPT的減毒增效可以通過控制抗癌藥物的用量來優化。

為了探討HCPT對PC12細胞是否有誘導凋亡的作用,選擇濃度為1μmol/l的HCPT做進一步的研究。通過AO/EB染色發現,當1μmol/l HCPT處理細胞24 h后,細胞形態還可見,但細胞膜和核膜已經受到了破壞,EB可以與DNA結合部分被染成紅色?？梢姷湫偷脑缙诘蛲黾毎毎吮蝗境删G色,呈碎片狀,此外可能因為DNA漏出到細胞核之外而被EB染成紅色,細胞內可見紅色致密斑塊彌散于細胞內部?？梢娂毎吮蝗境砷偌t色的晚期凋亡細胞,以及凋亡小體形成。也可見極少數的被均勻染成紅色的壞死細胞。

為了進一步證明HCPT的毒副作用與細胞凋亡有關,探討細胞凋亡與細胞周期的關系,可通過流式細胞技術(FCM)來進一步研究細胞凋亡和細胞周期。FCM結果表明HCPT的確誘導了PC12細胞凋亡,并且誘導凋亡與細胞周期有關,細胞凋亡存在著周期特異性,提示為不同因素誘導的凋亡。1μmol/l的HCPT作用于PC12細胞12 h、24 h、48 h,G0/G1期細胞比例分別為29.90%、21.94%、14.07%,而對照為74.38%,與對照相比呈現出明顯減少。S期細胞在處理12 h、24 h、48 h后所占的比例為44.99%、23.08%、0.78%,與對照的20.77%相比,可見在藥物作用初期可能將細胞阻滯于S期。G2/M期細胞在處理12 h、24 h、48 h后所占的比例為25.12%、54.98%、85.14%,與對照的4.85%相比變化明顯。實驗組與對照組相比有統計學意義。細胞周期的變化提示HCPT的毒副作用可能與將PC12細胞阻滯于G2/M期有關。

抗癌藥物能恢復周期控制點的作用,使腫瘤細胞在任何一個環節出現障礙致細胞不能增殖[14]。有研究報道,HCPT誘導凋亡的機制可能與阻滯G1期和S期細胞有關[12]。許青等[15]研究了HCPT誘導胃癌細胞、肺癌細胞凋亡的機制,揭示了誘導細胞凋亡是其抗腫瘤作用的主要機制之一。同時本研究也表明HCPT對PC12細胞的毒副作用與細胞凋亡有關。用低劑量HCPT作用于喉鱗癌細胞,表現出G2/M阻滯,高劑量時表現出S期細胞阻滯[16]。本研究提示HCPT對PC12細胞的毒副作用也與細胞周期有關。

有關HCPT誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制研究很多,而應用HCPT對機體的毒副作用同樣受到重視,本實驗結果表明：HCPT在體外對PC12細胞的毒副作用表現在抑制生長,并且對細胞的抑制作用與HCPT的濃度有密切關系,在研究中發現細胞活性和HCPT的濃度可以分為三段。當選用HCPT抗腫瘤治療時,如果HCPT的濃度位于正常細胞的低濃度耐受區,而該濃度不位于癌細胞的低濃度耐受區,對機體而言就達到了減毒增效的作用。本研究提示在選用抗癌藥物治療時,癌細胞對藥物的敏感性和對機體的毒副作用值得進一步的研究。

[1] Seo MD,Lee KW,Lim JH,et al.Irinotecan combined with 5-fluorou racil and leucovorin as second-line chemotherapy for metastatic or relapsed gastric can cer[J].Jpn JC lin Oncol,2008,38(9)：589-595.

[2] Yao Y,Zhao H,Sun Y,et al.Combined chemotherapy of hydroxycampothecin with oxaliplatin as an adjuvant treatment for hum an colo rectal can cer[J].Tohoku J Ex p M ed,2008,215(3)：267-278.

[3] Yu ZJ,Yu JW,CaiW,et al.Evaluation of HCPT d14-double passaged intervening chem otherapy protocol for hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2005,11(33)：5221-5225.

[4] Rukenstein A,Rydel RE,Greene LA.Multiple agentsrescue PC12 cells from serum-free cell death by translationb and transcription independent mechanisms[J].JNeurosci,1991,11(8)：2552-2563.

[5] Kimura Y,Kimura H.H ydrogen sulfide protects neu rons from oxidative stress[J].FASEB J,2004,18(10)：1165-1167.

[6] Joanne M,Rirka G,Anna J,et al.Inositol steroisomer stebilize an oligometric aggregate of Alzhemier amyloid-induced toxicity[J].Biol Chem,2000,275(24)：18495-18502.

[7] Shafer TJ,A tchison WD.Transmitter ion channel and receptor properties of pheochrom ocytoma(pc l2)cells：amodel for neurotoxicological studies[J].Neurotoxicology,1991,12(3)：473-492.

[8] Sinha BK.Topoisomerase inhibiters Areview of their therapeu ticpotential in cancer[J].Drugs,1995,49(1)：11-19.

[9] Malonne H,Atassi G.DNA topoisomerases targeting drugs：mechanism s of action and perspectives[J].Anticancer Drugs,1997,8(9)：811-822.

[10] Lansiaux A,Facompre M,Wattez N,et al.Apoptosis induced by the homocam ptothecin anticancer d rug BN 80915 in H L-60 cells[J].Mol Pharmacol,2001,60(3)：450-461.

[11] Philippart P,H arper L,Chaboteaux C,et al.Homocamptothecin,an E-ring-modified camp tothecin,exertsmo repotent antip roliferative activity than other topoisomerase Iinhibitors in hum an colon cancers obtained from surgeryand m ain tained in vitro under histotyp ical culture conditions[J].C lin Cancer Res,2000,6(4)：1557-1562.

[12] 羅執芬,周云,劉明月.羥基喜樹堿對胃癌細胞凋亡和細胞周期的影響[J].醫藥論壇雜志,2007,28(9)：1-2.

[13] 張一,鄧群,胡國信,等.羥基喜樹堿對HSC-T6細胞增殖與凋亡的影響[J].中華肝臟病雜志,2010,18(3)：199-203.

[14] 王紅寧,左國偉,陳地龍,等.人參皂苷Rbl、Rgl、Re對白血病細胞株KG1α增殖的影響[J].生物技術,2010,20(2)：56-58.[15] 許青,王杰軍,郭靜,等.羥基喜樹堿誘導人肺癌細胞SPC-A-1的凋亡[J].腫瘤,2000,20(1)：12-22.

[16] Chai LP,Su ZZ,Xian ZX.Inhibition of hyd roxycam ptothecin on laryngeal squamous carcinom a cell line[J].Ai Zheng,2003,22(4)：372-375.

[17] Fu YR,Yi ZJ,Yan YR,et al.H ydroxycamptothecin-induced apoptosisin hepatoma SMMC-7721 cells and the role of mitochond rial pathway[J].Mitochondrion,2006,6(4)：211-217.

[18] Fan H T,Li Z,Zhu DC,et al.Inhibition of proliferation,antiinvasion and induction of apoptosis in bladder cancer cells by 10-HCPT[J].Life Science Research,2005,9(1)：90-93.

[19] Wu Y,Zeng FQ,Wang YB,et al.Hydroxycam ptothecin promotes the apoptosis of prostate cancer cell line PC-3[J].National Journal of And rology,2007,13(10)：890-894.

[20] Tu SP,Jiang SH,Tan JH,et al.Themechanisms of apoptosis induced by hydroxycamptothecin in gastric cancer cells[J].Chinese Jou rnalof Digestion,2001,21(5)：274-277.

[21] 杜江,魏壽江,劉博,等.結直腸癌術中區域化療的安全性評價[J].成都醫學院學報,2009,4(2)：91-96.

[22] Franke JC,Plotz M,Prokop A,et al.New caspase-independen t but ROS-dependent apoptosis path way s are targeted in melanoma cells by an iron-containing cytosine analogue[J].Biochemical Pharmacology,2010,79(4)：575-586.