半固相生化反應(yīng)試劑板的研制*

高德祿 張世俊 牛 剛 張金樹

隨著生物技術(shù)的進步，醫(yī)學(xué)診斷必然向著更方便、更靈敏、更準確的方向邁進。而實驗技術(shù)儀器的小型化、操作簡單化、結(jié)果報告即時化的新檢驗?zāi)Ｊ皆絹碓绞艿饺藗兊那嗖A，并適應(yīng)當(dāng)今社會發(fā)展高效快節(jié)奏的工作方式，滿足人們在時間上的要求，可使患者盡早得到診斷治療。

半固相化學(xué)反應(yīng)技術(shù)是指將某檢測項目所需的多種試劑分別固定于載體板上，當(dāng)微量液態(tài)樣品加到載體板上后，通過低速離心準確將樣品滲濾分別與各室試劑發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生顏色，最后通過檢測顏色的程度計算出樣品中檢測項目的含量。通過研究擬將載體板改為雙層透明的膠板，并設(shè)計同板對照區(qū)，使比色反應(yīng)符合郎白-比爾定律，結(jié)果更為準確可靠，操作更為簡單便捷。

可檢測項目主要為鉀、鈉、血糖、尿素、肌酐等。現(xiàn)將半固相生化反應(yīng)試劑板的研制介紹如下∶

1 方法

1.1 試劑成分的研發(fā)

首先參考我國衛(wèi)生部醫(yī)政司頒布的全國臨床檢驗操作規(guī)程第三版，并對進口干式生化儀的部分檢測項目(血鉀、鈉、二氧化碳、葡萄糖、尿素氮、轉(zhuǎn)氨酶)進行方法學(xué)摸索，確定反應(yīng)方法、反應(yīng)時間和波長等參數(shù)。以上檢測項目均采用酶法，試劑成分及濃度均進行大量實驗摸索以達到優(yōu)化。

1.2 半固相反應(yīng)板模型的建立

通過對半固相載體的材料成分研究，獲取滲透性好且不參與整體反應(yīng)的凝膠物質(zhì)，分區(qū)鋪入載體板，同時檢測卡標識有密碼磁帶，與信息系統(tǒng)配合，將反應(yīng)所需的全部資料通過讀碼器輸送給檢測儀的微機，包括項目名稱、范圍、方法、反應(yīng)時間、波長選擇等；載體板分為試劑載體區(qū)和透明比色區(qū)，使比色反應(yīng)符合郎白-比爾定律，結(jié)果更為準確可靠。后期將設(shè)計CD盤式樣的檢測儀和微機操控低速離心來達到樣品與各個反應(yīng)室反應(yīng)，提高固相化學(xué)反應(yīng)的準確性和重復(fù)性。

1.3 半固相反應(yīng)板性能測試

研發(fā)出多項微量生化檢測卡，多個項目可集成為圓形單體也可自行組合。收集健康查體人群的新鮮血液標本50份，取微量全血滴于試劑板上的標本孔，血細胞等雜質(zhì)被濾膜阻隔，置于檢測儀；血清經(jīng)一定時間離心與固相試劑一步或兩步溶解反應(yīng)顯色，在特定波長下進行檢測分析。同時血液標本經(jīng)3000 rpm/min離心5 min后，于生化自動分析儀BECKMAN C800上進行相同項目的檢測，試劑均為BECKMAN原裝試劑，檢測結(jié)果進行相關(guān)性比較。

2 結(jié)果

2.1 確定檢測項目各種參數(shù)

各檢測項目參數(shù)分別為∶①血鉀，酶法，兩點速率法，波長為340 nm。試劑Ⅰ主要含有磷酸烯醇丙酮酸、ADP、NADH、丙酮酸激酶等。試劑Ⅱ主要含有LDH；②血鈉，酶法，兩點速率法，波長為405 nm。試劑I主要含有β-D-半乳糖苷酶等。試劑Ⅱ主要含有鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷酶；③二氧化碳，酶法，兩點速率法，波長為340 nm。試劑主要含有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸、蘋果酸脫氫酶、NADH等；④葡萄糖、己糖激酶法，速率法，波長為340 nm，試劑主要含有己糖激酶、葡萄糖6-磷酸葡萄糖酸、NADP等；⑤尿素氮，酶偶聯(lián)速率法，波長為340 nm，試劑主要含有尿素酶、α-酮戊二酸、NADH等；⑥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，速率法，波長為340 nm，試劑主要含有丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH等；⑦天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，速率法，波長為340 nm，試劑主要含有天門冬氨酸、α-酮戊二酸、NADH等。

優(yōu)化反應(yīng)成分的原則是試劑成分宜在干燥密閉狀態(tài)下長期保存，經(jīng)血液標本潤濕后能夠迅速溶解，且在短時間內(nèi)(5 min)可反應(yīng)顯色或顯濁度，達到檢測時間短、結(jié)果準確的目的。研制中采用多層隔膜技術(shù)將試劑固化分隔，保障有效參與反應(yīng)且可排除標本中的有色干擾物質(zhì)，大量標本測試并與自動化分析檢測結(jié)果比較，最終確定反應(yīng)成分的各種濃度。

2.2 半固相反應(yīng)板模型的獨到優(yōu)勢

半固相反應(yīng)板模型技術(shù)有獨到的優(yōu)勢。①采用離心式快速半固體生化檢測，標本不需預(yù)處理，血漿通過輔助層消除干擾物在經(jīng)過轉(zhuǎn)移層到反應(yīng)區(qū)，有效降低基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響；②采用酶工程技術(shù)使得固定化的酶具有“分子識別”的功能而清除干擾物質(zhì)；③除試劑卡外無其他任何廢液、廢物，且其便攜式的儀器性能優(yōu)異而又小巧玲瓏；④檢測卡大小為1 cm×3 cm，易于保存，穩(wěn)定性好，室溫下存貯于小筒內(nèi)，可作單一參數(shù)分析，也可進行多參數(shù)聯(lián)合檢測；⑤檢測卡條碼化，微機系統(tǒng)自動根據(jù)磁帶上提供的參數(shù)控制反應(yīng)時間和光學(xué)檢測；⑥配備自檢條監(jiān)測儀器和檢測卡的狀態(tài)；⑦工作條件易滿足，只需一般干電池即可；⑧無需其他配套儀器，節(jié)省檢驗空間，為快速檢驗提供了極大的可能與方便。

2.3 半固相反應(yīng)板性能評價

收集健康查體人群的血液標本50份，取微量全血分別滴于試劑板上的標本孔，在一定時間內(nèi)、特定波長下進行檢測分析。同時血液標本經(jīng)3000 rpm/min離心5 min獲得血清，血清于生化自動分析儀及免疫自動分析儀進行相同項目的檢測并進行相關(guān)性比較(見表1)。

表1 項目測試結(jié)果比較(n=50)

3 結(jié)論

POCT也稱即時檢驗，由于分析方法簡單、快速、正確，同時因為是現(xiàn)場分析，極大減少了樣品轉(zhuǎn)送流程，既縮短了報告時間，也降低了發(fā)生差錯的機會，實現(xiàn)了個性化的服務(wù)。反應(yīng)原理主要包括∶干化學(xué)測定、免疫測定、生物傳感器技術(shù)、生物芯片技術(shù)，也可多技術(shù)綜合應(yīng)用[1-3]。

干化學(xué)測定包括尿液分析試條和血液干化學(xué)分析，已在臨床檢驗中普遍采用。尿液分析增至10多項。血液干化學(xué)測定儀可測膽固醇、甘油三脂、葡萄糖、ALT、AST、膽紅素、肌酸激酶、尿素、肌酐、尿酸和淀粉酶等。

免疫層析試驗可測感染性疾病的抗原抗體、心肌標志、腫瘤標志、激素和各種蛋白質(zhì)等，適合于定性。

新一代POCT儀器使用生物傳感器，利用離子選擇電極，底物特異性電極，電導(dǎo)傳感器等特定的生物檢測器，是酶化學(xué)、免疫化學(xué)、電化學(xué)與計算機技術(shù)的結(jié)合。

生物芯片是最新發(fā)展的新技術(shù)，其特點是在小面積的芯片上同時測定多個項目。目前可分基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和細胞芯片，相信不久的將來芯片式的POCT儀將逐步應(yīng)用到各個領(lǐng)域。

野戰(zhàn)醫(yī)學(xué)檢驗是各種災(zāi)難現(xiàn)場傷病員救治不可缺少的部分，但我國檢驗醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)方法、檢測項目等都相對滯后，因此研制高科技、低成本、體積小、重量輕能滿足急救檢驗為主要目的且便于裝備基層醫(yī)療機構(gòu)，特別是偏遠地區(qū)的檢驗設(shè)備具有很大的重要性和迫切性。研究組借用市售國外檢測卡的檢測原理并加以突破。考慮對檢測時間的要求，多采用酶速率法，并對產(chǎn)品進行合理的工藝改革和優(yōu)化，成功獲得不同檢測項目甚至多項目集成的檢測卡。通過與所研發(fā)精密度好、結(jié)實耐用的檢測儀器配合使用，如溫控系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、反應(yīng)檢測時間等參數(shù)進行調(diào)試，保證良好的重復(fù)性和準確性，在現(xiàn)場操作中具備小巧靈活、操作簡單、快速檢測、檢測性能且和常規(guī)使用方法相媲美等優(yōu)點。

此研究著重研制適應(yīng)野外條件下工作的便攜式快速檢驗檢測卡，它集現(xiàn)代化學(xué)、光學(xué)、酶工程、新材料、化學(xué)計量學(xué)和計算機技術(shù)于一體，完全可以及時準確檢測患者電解質(zhì)（K+、Na+）、葡萄糖、尿素氮、肌酐以及轉(zhuǎn)氨酶等生命的重要指標，可為傷病員在第一時間獲得有效救治提供可靠依據(jù)，更好提高基層單位的醫(yī)療保障能力。經(jīng)與臨床常規(guī)方法比較，兩者相關(guān)性良好，完全符合急救需要，并與其他報道結(jié)果相近[4-5]。

半固相生化檢測卡和檢測儀的工作條件易滿足，只需一般干電池即可；無需其他配套儀器，節(jié)省檢驗空間。由于其準確度、精密度高，可測定少量檢品，不需配制試劑，操作簡便快速，無需過多培訓(xùn)，檢測可隨時隨地進行，尤其適合野外野戰(zhàn)條件下衛(wèi)生所一級急救、前線醫(yī)院和一些特殊條件下的使用，為野戰(zhàn)環(huán)境下快速檢驗提供了極大的可能與方便，充分展示其獨到優(yōu)勢。

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