人參皂甙Rb1對馬桑內酯致癇大鼠海馬組織蛋白質組的影響*

徐 倩， 張春來， 楊 燁， 張春燕， 趙春玲

(瀘州醫學院1生理教研室;2生物化學教研室，四川瀘州646000)

癲癇(epilepsy)是多基因介導的遺傳易感性和后天性諸 多因素等共同促成的一類復雜的慢性腦部疾病。海馬既是癲癇好發部位，也是癲癇研究最多的部位［1］。既往研究顯示，癲癇發作后引起包括腦神經元凋亡在內的神經元死亡，人和動物癲癇病灶中存在神經元數目減少現象以海馬神經元多見。馬桑內酯(Coriaria lactone，CL)是從抗精神病中草藥馬桑寄生中提取的有效成分，具有強烈的致癇作用。采用CL建立癲癇模型是研究癲癇的重要手段［2］。人參皂甙Rb1(ginsenoside Rb1，GRb1)系從人參中提取的單體，可通過抗氧化、抑制一氧化氮合酶活性、減少一氧化氮的過量產生、阻止細胞外Ca2+內流減輕鈣超載;也有報道［3］提示GRb1具有拮抗海馬神經細胞凋亡的作用。但GRb1對癲癇的治療國內外尚未見報道。本研究采用蛋白質組學的研究方法，通過雙向凝膠電泳(two－dimensional electrophoresis，2－DE)、質譜分析和生物信息學等技術方法，獲得大鼠海馬組織蛋白質圖譜，以尋找與CL癲癇損傷及GRb1神經保護作用有關的蛋白成分，為深入了解癲癇發病機制、發掘早期診斷的標志物以及有價值的治療性靶分子奠定基礎。

材料和方法

1 材料

健康成年雄性SD大鼠，體重240－260 g，由瀘州醫學院動物科提供;馬桑內酯購自華西醫科大學制藥廠;人參皂甙Rb1購自成都蓉金醫藥科技開發有限公司;蛋白定量和雙向電泳所用試劑均購自Bio－Rad。主要實驗儀器包括:組織勻漿器(北京鼎國公司)，Labofuge 400R冷凍離心機(Heraeus)，Protean IEF 電泳儀(Bio－Rad)，Protean II Multi－Cell垂直電泳系統(Bio－Rad)，凝膠圖像掃描儀 PowerLook 1100(UMAX)，4700串聯飛行時間質譜儀(ABI)。

2 方法

2.1 模型制備及動物分組 參照柴慧霞等［4］制作的大鼠癲癇模型，并參照Diehl等［5］的癲癇分級標準對癲癇發作進行分級:0級:無異常行為;I級:須動，咀嚼，跑動;Ⅱ級:頭面部抽搐;Ⅲ級:上肢或下肢間斷性抽搐;IV級:四肢和軀干持續節律性抽搐;V級:四肢和軀干強直性抽搐或伴有翻滾、跌倒等表現。Ⅲ級及Ⅲ級以下為輕型發作，Ⅳ級及以上為重型發作。

選取雄性成年SD大鼠30只，隨機均分為3組:對照組、CL致癇組和GRb1+CL致癇組。GRb1+CL致癇組大鼠用GRb1(30 mg/kg)每天灌胃1次，連續3 d，第4 d腹腔注射CL(4 mg/kg)，觀察其行為學改變。自腹腔注射CL后開始計時，3 h后取材。CL致癇組除實驗前3 d用等量生理鹽水灌胃外，余處理同GRb1+CL致癇組。對照組除第1 d腹腔注射等量生理鹽水外，余處理同CL致癇組。

2.2 樣品制備及雙向電泳 根據癲癇發作程度、潛伏期及發作持續時間等確定造模成功。每組各取3只大鼠斷頭處死取腦組織并剝離海馬，取海馬組織60 mg+300 mL裂解液冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心1 h，收集的上清液即為蛋白質提取物。用Bradford法測定各樣品的總蛋白含量，分裝，－80℃保存備用。采用17 cm的線性固定pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)預制干膠條(pH 4 －7)，每根膠條上樣量260 μg，按照Bio－Rad說明書進行第一向固相pH梯度等電聚焦，總伏時數約為80 000。隨后按常規方法進行第二向SDS－PAGE。

2.3 數據分析及質譜鑒定 采用銀染法對雙向電泳后的凝膠進行染色。采用ImageMaster 2D Platinum 5.0分析軟件進行蛋白質的差異分析，以GRb1+CL致癇組凝膠作為參考膠分別與對照組和CL致癇組凝膠進行蛋白斑點匹配，在CL致癇組和GRb1+CL致癇組分別選取相對表達量差異達5倍以上的蛋白斑點各3個，膠內酶切，進行 MALDI－TOF－MS鑒定，獲得各蛋白斑點的肽指紋圖譜。再結合這些蛋白斑點的pI和MW等信息，使用肽指紋圖譜匹配軟件Mascot檢索匹配GenBank數據庫進行蛋白斑點的鑒定。

3 統計學處理

采用SPSS 11.5軟件分析。計量資料數據以均數±標準差(±s)表示。單變量配對資料之間的比較采用配對樣本t檢驗。

結 果

1 大鼠行為學改變

對照組大鼠未見癇性發作。CL組癇性發作程度較高，在注射CL后15－20 min左右即出現Ⅲ一Ⅳ級發作，持續5－10 min，間隔3－5 min再次發作，但程度較前次輕，之后發作間隔時間延長，程度逐漸減輕。與CL組相比，Rb1+CL組大鼠的癇性發作程度明顯減低，潛伏期變長，持續時間變短(P＜0.01)，差異顯著，見表 1、2。

表1 各組大鼠癲癇發作級別比較Table 1.Comparison of seizure intensity among the three groups

表2 各組大鼠癲癇發作潛伏期和持續時間比較Table 2.Comparison of latent period and duration time among the three groups(min.±s.n=10)

表2 各組大鼠癲癇發作潛伏期和持續時間比較Table 2.Comparison of latent period and duration time among the three groups(min.±s.n=10)

##P ＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs CL epileptic group.

Control 0 0 CL epileptic 16.29 ±0.37## 7.51 ±0.48##GRb1+CL epileptic 34.35 ±0.42＊＊ 2.45 ±0.39＊＊

2 蛋白質圖譜改變

GRb1+CL 致癇組與CL致癇組和對照組相比，蛋白質圖譜發生了明顯改變，主要表現為蛋白質斑點數量的增減和灰度值的變化。GRb1+CL致癇組與對照組的差異蛋白斑點有84個，GRb1+CL致癇組與CL致癇組的差異蛋白斑點有120個，這些表達差異的蛋白質斑點絕大部分集中于pH 4.2－6.7的偏酸性區域，相對分子量主要介于16－96 kD，見圖1、2。

Figure 1.2－DE maps of proteome from hippocampus of rats in each group.A:control group;B:CL epileptic group;C:GRb1+CL epileptic group.圖1 各組大鼠海馬組織蛋白質2－DE圖譜

Figure 2.Identified protein spots by mass spectrometry.A:CL epileptic group;B:GRb1+CL epileptic group.圖2 質譜鑒定的蛋白點

3 蛋白質鑒定

篩選出的6個差異表達的蛋白質斑點進行MALDI－TOF－MS檢測，獲得了各蛋白質斑點的肽指紋圖譜(圖3所示為所檢測的第6點的蛋白質肽指紋圖譜)。鑒定出的這6個差異表達的蛋白質為腦肌酸激酶(brain creatine kinase)、內吞蛋白A1(endophilin－A1)、UPF0628蛋白C10orf96同源物(UPF0628 protein C10orf96 homolog)、細胞色素P－450(cytochrome P－450)、光導素樣蛋白(phosducin－like protein)及橋整合蛋白3(bridging integrator 3)，見表3。其中前3個蛋白質在GRb1+CL致癇組表達低于CL致癇組，后3個蛋白質在GRb1+CL致癇組表達低于對照組。

Figure 3.Peptide mass fingerprinting of the number 6 protein spot from 2－DE maps of GRb1+CL group.圖3 GRb1+CL組2－DE圖譜中蛋白斑點6的肽指紋圖譜

表3 質譜分析鑒定的蛋白質Table 3.Identified proteins by mass spectrometry

討 論

已鑒定出6個差異表達的蛋白斑點，其中腦肌酸激酶、吞蛋白A1和UPF0628蛋白C10orf96同源物在CL致癇組表達高于GRb1+CL致癇組，由此推測它們可能與CL所致的癲癇發作和海馬神經元損傷有關，也可能與GRb1減輕癲癇發作和神經元損傷有關。

腦肌酸激酶，是在腦內催化ATP和肌酸轉化為ADP和磷酸肌酸的特殊同工酶，可能在小腦的發育過程中參與ATP的產生過程。有研究表明，腦肌酸激酶活性高低與原發腦實質損傷程度成正比，損傷越重，對腦實質破壞范圍越大，腦肌酸激酶活性越高。本實驗中CL致癇組腦肌酸激酶表達上調說明可能與CL誘導大鼠癲癇發生后引起的腦損傷有關。同時腦肌酸激酶在GRb1+CL致癇組表達下調說明可能是由于GRb1抑制其活性而產生的神經保護作用。內吞蛋白A1，是一種脂質酵素，屬于內吞蛋白家族，含有1個BAR結構域和1個SH3結構域，其功能和磷脂酶A2相反，與突觸囊泡的內吞作用相關，負責在細胞內外轉運物質。UPF0628蛋白C10orf96同源物屬于UPF0628蛋白質家族，其功能尚未闡明。

細胞色素P－450、光導素樣蛋白和橋整合蛋白 3在GRb1+CL致癇組表達低于對照組，推測可能是GRb1通過抑制這3種蛋白質的表達而發揮神經保護作用。細胞色素P－450是廣泛存在于生物體內的一類含血紅素和硫羥基的蛋白。細胞色素P－450同工酶是血紅蛋白超級家族，參與外源性物質的代謝，所產生的代謝產物可能有毒性或致癌性。P－450代謝活性產物造成細胞損傷有2條途徑［6］:(1)藥物活性代謝產物直接與細胞內大分子如DNA、蛋白質共價結合，破壞細胞內穩態，導致細胞凋亡(壞死);(2)通過與氧分子作用產生活性氧產物，從而引起細胞突變，脂質過氧化破壞細胞結構和蛋白，大量Ca2+內流激活Ca2+依賴蛋白酶和核酸酶，最終導致細胞死亡。俄羅斯醫學科學院Myasoedova認為［7］，在一定條件下細胞色素P－450能夠產生活性氧，最近在線粒體中也發現微粒體細胞色素P－450的類似物，推測它能導致線粒體功能紊亂、細胞凋亡，還可能參與了一些疾病的發生。細胞色素P－450在 GRb1+CL致癇組表達下調，說明GRb1可能通過抑制細胞色素P－450的表達而起到抗細胞凋亡的作用。光導素樣蛋白，通常以βγ復合物的形式存在，是一種GTP結合蛋白，為信號轉導蛋白。有研究認為［8］，光導素樣蛋白作為分子伴侶參與G蛋白βγ二聚體的裝配過程，其缺失可抑制G蛋白βγ二聚體的形成，影響G蛋白信號轉導系統的信號傳遞過程。信號轉導在難治性癲癇的發病機制中起著重要作用［9］，胞外信號腦源性神經生長因子、神經遞質通過跨膜結構酪氨酸受體激酶、G蛋白耦聯受體;神經細胞黏附分子介導的細胞直接接觸都可激活胞內蛋白激酶，如絲裂素活化蛋白激酶、蛋白激酶C，通過調節神經元生長、分化、凋亡和誘導神經元重組等方式參與難治性癲癇的發病。橋整合蛋白3，包含1個BAR結構域，與胞質分裂和分隔有關，在纖絲狀肌動蛋白的定位中有一定作用，以解聚時的球狀肌動蛋白或聚合時的纖絲狀肌動蛋白形式存在。正常細胞中肌動蛋白2種形態的轉換處于動態平衡，共同行使細胞的變形運動、胞質分裂、基質附著和胞間連接等多項功能［10］。它們在細胞的形態維持、物質運輸、信號轉導、能量轉換及細胞的運動和分裂等多個過程中發揮著重要的作用［11］。

本研究中已鑒定的相關蛋白質涉及細胞凋亡、細胞信號轉導、物質轉運等，提示癲癇發生和發展過程可能涉及相應的病理生理過程。今后將結合細胞信號轉導途徑從細胞整體生理活動變化的角度分析上述已鑒定的差異表達蛋白質在癲癇發生和發展過程中的生物學意義，以期獲得對癲癇發病機制更深刻的理解，發掘出早期診斷的標志物以及有價值的治療性靶分子。

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