L－精氨酸、氨基胍和胍丁胺在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用*

王露茜， 賈 靜， 郭明發， 張 耀， 張翔宇， 郭軍軍， 耿若君， 李 炳， 鐘 華， 李東亮△

(1新鄉醫學院生理學與神經生物學教研室，河南新鄉453003;2上海交通大學醫學院，上海200025;)

一氧化氮(nitric oxide，NO)在缺血性腦損傷中具有損傷及保護雙重作用，與組織損傷的發展進程和產生一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的類型密切相關。在腦組織中，L－精氨酸(L－arginine，L－Arg)作為底物在NOS的作用下生成NO。將NO前體和NOS抑制劑應用于腦缺血的研究已有報道，但作用結果尚有爭議［1］。L－Arg在精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase，ADC)作用下脫羧基產生胍丁胺(agmatine，AGM)。AGM作為一種新型神經遞質或神經調質，具有增強阿片類藥物鎮痛效果、減少缺血再灌注損傷、保護神經元等作用［2］。因其具有良好的藥理學鎮痛作用，因此將其應用于腦損傷的治療將具有雙重療效。但AGM和NO的相互作用目前尚無一致報道［3］。本實驗利用線栓法建立大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，在大鼠腦缺血后分別給予NO前體L－Arg、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抑制劑氨基胍(aminoguanidine，AG)及AGM，求證它們對缺血性腦損傷的保護作用，并探討各自的腦保護作用機制。

材料和方法

1 主要試劑與儀器

L－Arg、AG和AGM購自Sigma;iNOS免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司;NO檢測試劑盒購自碧云天生物工程有限公司。

2 方法

2.1 實驗動物及分組 健康成年雄性Sprague－Dawley大鼠90只，清潔級，體重(280±20)g，新鄉醫學院實驗動物中心提供。將75只大鼠隨機分為5組:假手術組、模型組、AG組、L－Arg組和AGM組，每組15只。每組根據再灌注時間又隨機分為再灌注12 h組、再灌注24 h組和再灌注72 h組，每組5只。假手術組只作頸部切開，分離頸總動脈但不插拴線;AG組、L－Arg組和AGM組均于缺血模型成功建立后即刻給藥，AG組腹腔注射給予AG(100 mg/kg)1 mL，L－Arg組腹腔注射給予L－Arg(500 mg/kg)1 mL，AGM組尾靜脈給予AGM(40 mg/kg)1 mL;模型組腹腔注射等容積的滅菌生理鹽水。

2.2 動物模型的制備 參照Longa等［4］的線栓法，采用頸內動脈線栓法建立大鼠右側MCAO模型。大腦中動脈栓塞2 h后，乙醚麻醉下抽出栓線，恢復大腦中動脈血液灌注。再灌注后20 min待動物清醒，參照Longa評分標準給予行為學評分:無神經病學征象為0分;豎毛，輕度運動低下為0.5分，前肢屈曲，有運動障礙為1分;行動不協調，屈曲姿勢，旋轉運動為2分;偏癱，不能站立行走為3分;痙攣，昏睡為4分，死亡為5分。分數越高，動物的行為障礙越嚴重。

2.3 取材與NO檢測 用水合氯醛(3 mL·kg－1)麻醉大鼠后迅速打開胸腔暴露心臟，右心室取血 3 mL，3 000 r·min－1，離心 10 min，提上清，打入 1 mL Eppendorf管中置于超低溫冰箱待用。將灌注針頭迅速自左心室插入到升主動脈，剪開右心耳，依次灌注生理鹽水100 mL，多聚甲醛(20 g·L－1，pH 7.4)300 mL，3 h完畢。大鼠斷頭取腦，置于多聚甲醛(20 g·L－1，4 ℃)24 h ，常規脫水，在 20% 蔗糖溶液和30%蔗糖溶液進一步脫水固定。冰凍切片厚10 μm，放入腦片保護液中4℃保存1 d。大腦切片進行常規蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，觀察腦內海馬區神經元細胞的結構及損傷情況。血清NO含量測定時，先取出備用血清，用Bio Tek ELX800酶標儀，嚴格按NO檢測試劑盒說明書測NO含量。

2.4 iNOS表達檢測 以免疫組化ABC法觀察腦內iNOS表達變化。顯微鏡下計數各組每只大鼠相應腦區內iNOS陽性表達的細胞數。在高倍鏡下(×400)隨機選擇5個視野，每個視野計數200個細胞，計算平均百分率。根據細胞染色程度和著色細胞比例確定計分:不染色=0，輕度染色=1，中度染色=2，強染色=3;無細胞著色=0，＜25%細胞著色=1，26% －50%細胞著色=2，51% －75%細胞著色=3，＞75%細胞著色=4。兩者計分之和大于或等于2為陽性，2－3分為+;4－5分為++;6－7分為+++。結果的判定由2位不知實驗資料情況的臨床病理醫師進行計數。

3 統計學處理

采用SPSS 11.0軟件分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示。多組均數間比較采用單因素方差分析，兩樣本均數比較采用t檢驗。

結 果

1 大鼠行為學變化

各組大鼠行為學評分結果見表1。缺血再灌注12 h，LArg組行為學評分顯著低于模型組(P＜0.05);AG組(P＜0.01)和AGM組(P＜0.05)在缺血再灌注24 h，其行為學評分均顯著低于模型組，而在缺血再灌注12 h，均明顯高于LArg組(P＜0.05)。其余指標差別無統計學意義。

表1 術后12、24、72 h 5組大鼠神經行為學評分Table 1.The neurobehavioral scores in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation(±s.n=5)

表1 術后12、24、72 h 5組大鼠神經行為學評分Table 1.The neurobehavioral scores in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation(±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;△P ＜0.05 vs L － Arg group.

Group 12 h 24 h 72 h Sham operation 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 3.00 ±1.22 Model 3.40 ±0.89 3.80 ±0.45 3.80 ±0.84 L －Arg 2.35 ±0.38* 3.00 ±0.71 3.20 ±0.84 AG 3.20 ±0.44△ 2.40 ±0.71＊＊ 3.00 ±0.71 AGM 3.00 ±0.71△ 2.60 ±0.55*

2 血清NO含量變化

各組大鼠血清中NO含量結果見表2。與假手術組相比，模型組、L－Arg組、AG組和 AGM組在缺血再灌注12、24、72 h的NO含量均顯著增加(P＜0.05);與模型組相比，LArg組在缺血再灌注12 h的NO含量顯著升高(P＜0.01);AG組和AGM組在缺血再灌注24、72 h的NO含量顯著降低(P＜0.05)。AG組和 AGM組在缺血再灌注12、24、72 h的NO含量均顯著低于L－Arg組(P＜0.05);其余指標差別無統計學意義。

表2 術后12、24、72 h 5組大鼠血清中NO含量Table 2.The content of NO in serum in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation(±s.n=5)

表2 術后12、24、72 h 5組大鼠血清中NO含量Table 2.The content of NO in serum in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation(±s.n=5)

#P ＜0.05 vs sham operation group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;△P ＜0.05 vs L－Arg group.

Sham operation 946.60 ±214.31 1 093.30±465.83 884.66±295.69 Model 2 500.00±480.10# 3 872.20±449.62# 3 600.00±443.12#L －Arg 4 366.60 ±696.04#＊＊ 3 886.50±360.68# 3 500.00 ±488.61#AG 2 286.60±447.23#△ 3 133.30±320.07#＊△2 966.60±702.37#＊△AGM 2 260.0±408.74#△ 2 841.60±403.95#＊△2 611.10±454.73#＊△

3 HE染色病理觀察

光鏡下假手術組腦組織未見明顯異常;隨著再灌注時間的延長，模型組手術側的海馬區和皮層區組織均出現明顯改變，擴張的血管周圍有中性粒細胞浸潤，神經元細胞可見核周水腫，細胞輪廓消失、溶解等壞死性改變等程度加重。與模型組相比，L－Arg 12 h組、AG 24 h組和AGM 24 h組病變范圍明顯縮小，變性神經元數目明顯減少，間質水腫程度明顯減弱。

4 iNOS的表達

各組大鼠免疫組織化學iNOS陽性細胞計數結果見表3。與假手術組相比，各時點模型組及治療組的iNOS陽性細胞均明顯增加(P＜0.05)。與模型組相比，缺血再灌注L－Arg組iNOS陽性細胞數在3個時點無顯著差異(P＞0.05)，而AG組、AGM組均明顯減少(P＜0.05)。而與L－Arg組相比，AG組和AGM組的iNOS陽性細胞數在3個時點均顯著降低(P＜0.05)。AG組和AGM組相比，在3個時點iNOS陽性細胞數無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 1.Neuronal changes in different groups 12 h and 24 h after reperfusion following ischemia(HE staining，×400).A:sham operation group(12 h);B:model group(12 h);C:L－Arg group(12 h);D:model group(24 h);E:AG group(24 h);F:AGM group(24 h).

圖1 各組大鼠缺血再灌注12 h和24 h后神經元變化表3 5組大鼠免疫組化iNOS陽性細胞計數情況Table 3.Positive cells with iNOS protein in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation detected by immunohistochemical method(±s.n=5)

圖1 各組大鼠缺血再灌注12 h和24 h后神經元變化表3 5組大鼠免疫組化iNOS陽性細胞計數情況Table 3.Positive cells with iNOS protein in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation detected by immunohistochemical method(±s.n=5)

#P＜0.05 vs sham operation group;*P＜0.05 vs model group;△P＜0.05 vs L－Arg group.

Group 12 h 24 h 72 h Sham operation 0.40 ±0.55 0.40 ±0.55 0.20 ±0.03 Model 5.20 ±0.84# 5.20 ±1.10# 4.95 ±0.11#L － Arg 5.16 ±0.29# 4.60 ±0.55# 5.20 ±0.25#AG 1.80 ±0.84#＊△ 3.20 ±0.45#＊△ 4.08 ±0.88#＊△AGM 1.86 ±0.11#＊△ 3.31 ±0.18#＊△ 3.92 ±0.11#＊△

討 論

作為強烈的血管舒張因子和信息物質，NO在急性局灶性腦缺血損傷中的作用倍受研究者關注。NOS是NO合成的關鍵因素，體內NO含量的多少及其生物作用完全依賴于NOS的活性。因此，對NOS的測定是深入研究NO生理病理作用的重要環節。NOS在腦內至少有3種同工酶，分別為神經元型 NOS(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)、iNOS和內皮型NOS(endothelial nitric oxide synthase，eNOS);其中nNOS和eNOS為結構型同工酶(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)，與維持神經傳遞和血管舒張等生理功能有關;iNOS為誘導型同工酶，廣泛存在于小膠質細胞、星形膠質細胞、中性細胞、巨噬細胞等多種細胞中［5］。在生理情況下，iNOS并不表達;但病理條件下，一些細胞可誘導iNOS基因轉錄，啟動蛋白質合成，生成大量iNOS。iNOS的高表達產生大量的NO導致后續的過氧脂質化過程可引起DNA斷裂、神經元凋亡和血腦屏障開放，因此iNOS被認為是一種“病理型”酶［6］。

本實驗中，與模型組相比，L－Arg組在缺血再灌注12 h血清中NO含量顯著升高，而大鼠行為學評分也有明顯改善，HE染色發現病變范圍縮小，變性神經元數目明顯減少。該結果與以往研究相符，證實在腦缺血再灌注損傷早期，由NOS催化底物L－Arg生成一定量的NO可起保護作用。但是隨著缺血再灌注損傷的延續，以及NO釋放“第二窗”的開始，缺血再灌注損傷24 h后，iNOS催化產生的NO逐漸增多［7］，而大劑量的NO則產生明顯的細胞毒性作用。本實驗通過給予大鼠iNOS抑制劑(AG)治療后，可觀察到各時點大鼠血清中NO含量均較模型組有所下降，其中缺血再灌注24 h AG組NO含量顯著降低，行為學評分和腦組織病理性變化也有顯著改善。但L－Arg在24 h、AG在12 h對腦組織保護作用不明顯。

Figure 2.Expression of iNOS protein in different groups 12 h and 24 h after reperfusion following ischemia(immunohistochemical staining，×200).A:sham operation group(12 h);B:model group(12 h);C:L－Arg group(12 h);D:model group(24 h);E:AG group(24 h);F:AGM group(24 h).圖2 各組大鼠缺血再灌注12 h和24 h后iNOS 蛋白表達

有報道認為，AGM是NO合成的前體，且其舒血管作用可完全被NOS抑制劑L－NAME或去除肺動脈內皮細胞所取消［8］。而Galea等［9］研究結果顯示，AGM 不是NO 的前體，而是NOS的競爭性抑制劑，可抑制NO的產生。本實驗中AGM組在缺血再灌注12 h、24 h、72 h腦組織中NO含量均較模型組有所降低，且最大抑制活性發生在缺血再灌注24 h。在暫時性腦缺血模型中，iNOS在6 h就有表達，6－24 h作用明顯［10］，因此我們推測AGM是NOS競爭性抑制劑，且主要抑制iNOS。

通過本實驗，我們再次觀察到NO參與缺血性腦損傷的發展及其雙重作用。它們可能通過不同機制對缺血腦組織起不同作用，依賴于NO的不同來源和NOS在腦缺血不同時期的表達。腦缺血早期NO具有保護作用的機制可能是:升高平滑肌cGMP水平舒張腦血管;抑制血小板或白細胞黏附聚集;阻斷N－甲基－D－天冬氨酸(N－methyl－D－aspartate，NMDA)受體［11］;對突觸傳遞介質的調節;降低神經元胞漿中游離鈣的水平。但是，其詳細作用機理及臨床應用效果有待進一步深入研究。腦AGM作為一種內源性物質，能阻斷NMDA受體通道，進入神經膠質細胞后則調節NOS的表達及活性，抑制一氧化氮合酶(NOS)活性［12］。缺血再灌注后期，腦組織內iNOS生成過量NO加重缺血再灌注損傷。但以往的研究認為iNOS選擇性抑制劑AG，主要抑制NOS活性，減少NO生成，從而減輕過量NO介導的興奮性氨基酸毒性、減少氧自由基的生成、鈣超載、線粒體損傷等造成的缺血腦損傷［13，14］。但我們的研究發現:應用AG和AGM后，iNOS的蛋白表達均出現了下降，通過減少iNOS的數量減少NO的大量生成。但AG和AGM抑制作用的確切機制仍有待進一步研究。

綜上所述，12 h內我們可以應用L－Arg來促進NO的釋放，12－24 h之間可以應用AG、AGM抑制NO的產生。這2種方法可用于保護腦組織。選擇具有高度選擇性、高效低毒的臨床新藥，同時選擇合適的給藥時機和給藥途徑，將為臨床缺血性卒中早期治療開辟新的途徑，也為早期用溶栓等方法恢復腦血供后預防缺血再灌注損傷提供更佳的治療方案。

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