TNF－α對小鼠腦微血管內皮細胞RhoA活性的影響*

鄧小鹿， 彭 鏡， 何 芳， 楊麗芬， 吳麗文， 尹 飛

(中南大學湘雅醫院兒科，湖南長沙410008)

腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF － α)主要由單核細胞和巨細胞產生，在介導中樞神經系統感染的炎癥過程中起著重要作用。本實驗室前期研究證實，感染性腦水腫大鼠腦組織的TNF－α含量明顯增高，與腦水腫的嚴重程度呈正相關［1］;Rho激酶抑制劑Y－27632可以減輕TNF－α導致的腦微血管內皮細胞通透性增高［2］。同時，已有研究顯示RhoA/Rho激酶信號通路是調控內皮細胞屏障功能的重要環節，其中RhoA的活性由Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(Rho guanine nucleotide exchange factors， RhoGEFs)催 化。p115RhoGEF是第一個被發現聯系G蛋白偶聯受體和Rho家族的RhoGEFs，介導多種刺激因素如凝血酶、溶血凝脂酸、血栓素－2對RhoA的活化［3］。因此，我們認為p115RhoGEF可能也參與了TNF－α對RhoA的調控，而目前未見相關文獻報道。本研究檢測了TNF－α刺激小鼠腦微血管內皮細胞不同時點RhoA活性和蛋白表達水平，并通過siRNA抑制p115RhoGEF表達，探討其在TNF－α對RhoA活性調控中的作用。

材料和方法

1 材料

小鼠腦微血管內皮細胞株bEnd.3由美國芝加哥大學章堅教授饋贈，RhoA活性檢測試劑盒購自Cytoskeleton，DMEM高糖培養基購自Thermo，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自杭州四季青公司，重組人TNF－α購自Sigma，兔抗RhoA單克隆抗體購自CST，山羊抗p115RhoGEF多克隆抗體和HRP標記的羊抗兔IgG購自Santa Cruz，p115RhoGEF siRNA由上海吉凱基因技術有限公司合成。其余生化試劑為國產分析純試劑或進口分裝。

2 方法

2.1 細胞培養 應用 DMEM(含 10%FBS)培養液，在37℃、5%CO2培養箱條件下培養bEnd.3細胞，每3 d按1∶2的比例傳代，每日于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態與生長狀態，1－2 d更換1次培養液。

2.2 siRNA轉染 參考文獻［4］合成p115RhoGEF siRNA。合成引物序列如下:正義鏈5'－CAUACCAUCUCUACCGACGtt－3';反義鏈5'－CGUCGGUAGAGAUGGUAUGtt－3'。采用 Invitrogen公司的Lipofectamine 2000將p115RhoGEF siRNA轉染bEnd.3細胞，無活性的nsRNA作為對照。轉染72 h后，利用Western blotting驗證siRNA抑制p115RhoGEF蛋白合成的效果。

2.3 RhoA活性和表達分析及分組 將bEnd.3細胞分為正常對照組和TNF－α刺激組。去血清培養24 h，加入TNF－α(10 μg/L)刺激，在 10、30、60 min 利用 pull－ down 法檢測RhoA活性，得到TNF－α作用與RhoA活化的時效關系。取RhoA活化最明顯的時點，bEnd.3細胞轉染p115RhoGEF siRNA和nsRNA，檢測TNF－α刺激后RhoA的活性變化。Pull－down法操作步驟依照Cytoskeleton提供的RhoA活性測定試劑盒說明書進行。Western blotting檢測RhoA－GTP的表達，RhoA－GTP/總RhoA的比值代表RhoA活性。

將bEnd.3細胞分為正常對照組和TNF－α刺激組。去血清培養24h，分為1、3、6、12、24 h 組，加入 TNF － α(10 μg/L)進行預處理后收集各組總蛋白，Western blotting檢測RhoA蛋白表達變化。

2.4 Western blotting 每孔加樣品總蛋白量30 μg行SDSPAGE電泳分離及轉膜，Ⅰ抗工作效價為1∶500，ECL化學發光法顯影，Quantity One圖像分析系統進行顯影條帶灰度值分析。

3 統計學處理

結 果

1 Pull－down檢測TNF－α對bEnd.3細胞RhoA活性的影響

與對照組相比，bEnd.3細胞RhoA活性在TNF－α處理10 min無明顯變化;30 min明顯增高達到高峰(P＜0.01)，60 min稍下降但仍高于對照組(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Activation of RhoA by TNF－α.The bEnd.3 cells were incubated in the presence of TNF － α (10 μg/L)for the indicated time.A:RhoA activation was determined by pull－down assay.The RhoA －GTP pulled down from lysates was detected by Western blotting using a specific anti－RhoA antibody.The total amount of RhoA in cell lysates was used as a control for the comparison of RhoA activity.B:quantitation of pulldown experiments.±s.n=3.*P＜0.05.＊＊P＜0.01 vs control.圖1 Pull－down檢測TNF－α對bEnd.3細胞RhoA活性的影響

2 Western blotting檢測TNF－α對bEnd.3細胞RhoA蛋白表達的影響

RhoA總蛋白表達在TNF－α刺激12和24h上調，與對照組之間的差異顯著(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Time－course changes in the upregulation of RhoA protein induced by TNF － α (10 μg/L).The bEnd.3 cells were incubated in the presence of TNF－α(10 μg/L)for the indicated time points.A:total proteins were assayed for RhoA by Western blotting.The β －actin in cell lysates was used as a control.B:the expression levels of RhoA were summarized.±s.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖2 TNF－α對bEnd.3細胞RhoA蛋白表達量的影響

3 Western blotting鑒 定 siRNA 對 bEnd.3細 胞p115RhoGEF表達的抑制效果

與對照組相比，轉染 p115RhoGEF siRNA的細胞p115RhoGEF的表達明顯減少(P＜0.01)，分析顯示其蛋白條帶灰度值較對照組降低約91%，見圖3。

Figure 3.Suppression of endogenous p115RhoGEF protein by siRNA.A:the bEnd.3 cells were transiently transfected with active siRNA against p115RhoGEF(siRNA)or the non－silencing RNA(nsRNA)and the protein lysates prepared at 72 h.Total proteins were assayed for p115RhoGEF by Western blotting.The β－ actin in cell lysates was used as a control.B:the expression levels of p115RhoGEF were summarized.±s.n=3.＊＊P ＜0.01 vs nsRNA.圖3 siRNA對p115RhoGEF蛋白表達的影響

4 Pull－down檢測p115RhoGEF siRNA對TNF－α刺激后RhoA活性改變的影響

TNF－α作用30 min后p115RhoGEF siRNA組RhoA有部分活化，但較對照組明顯降低(P＜0.05)，分析顯示其蛋白條帶灰度值較對照組降低約51%，見圖4。

Figure 4.Effect of p115RhoGEF siRNA on TNF－α stimulated RhoA activation.A:p115RhoGEF siRNA or nsRNA were transfected into bEnd.3 cells and TNF － α －stimulated RhoA activation was measured by pulldown assay;B:quantitation of pull－down experiments.±s.n=3.*P＜0.05 vs nsRNA.圖4 p115RhoGEF siRNA對TNF－α刺激后RhoA活性改變的影響

討 論

TNF－α是介導炎癥、感染和其它內環境改變的重要起始因子，可直接損傷內皮細胞，導致應力纖維形成和細胞收縮。小G蛋白的Rho家族，由Rho、Rac和Cdc42三個亞家族組成，是一類能結合GTP的蛋白質，并能通過其下游效應蛋白介導多種生物功能包括細胞骨架形成、黏附、增殖和轉錄。近年研究表明，多種炎癥介質和細胞因子均能激活Rho/Rho激酶途徑，使肌球蛋白輕鏈磷酸化、肌動－肌球蛋白交聯增加、F－actin骨架重組和應力纖維生成，導致內皮細胞收縮［5］;Rho激酶抑制劑Y－27632可以抑制腫瘤細胞游走過程中引起的血管內皮單細胞層電阻下降［6］。為探討TNF－α對腦微血管內皮細胞RhoA的調控，本實驗觀察了TNF－α處理bEn.d3細胞后RhoA的活性和表達變化，證實TNF－α(10 μg/L)誘導RhoA活性增高，RhoA－GTP表達在刺激后30min和60min明顯增加，30min達到高峰，同時，總RhoA蛋白在TNF－α刺激后12 h和24 h上調，與在支氣管平滑肌細胞的研究結果一致［7］。我們的結果表明RhoA參與了TNF－α介導腦微血管內皮細胞內信號傳遞過程，RhoA的活性和表達增加可能是TNF－α損傷內皮細胞屏障功能的機制之一。

然而，TNF－α激活RhoA的具體機制仍不明確。RhoA的活化依賴GEFs催化GDP向GTP轉化，說明GEFs在RhoA活化的信號轉導中發揮關鍵作用。p115RhoGEF是1996年由Hart等［8］發現的特異活化RhoA的GEF;G蛋白α亞單位12/13(Gα12/13)轉導激動劑(如凝血酶和溶血凝脂酸)的信號，通過提高p115RhoGEF的GEF活性來激活RhoA。同時，Holinstat等［9］在外周血管內皮細胞的研究中，發現凝血酶誘導的RhoA活化和隨之的細胞骨架重組需要Gα12/13與蛋白激酶Cα(PKCα)共同對p115RhoGEF的激活。上述研究提示p115RhoGEF參與了外界刺激對RhoA活化的調控，而TNF－α活化RhoA是否受p115RhoGEF調控尚未見報道。我們使用RNA干擾技術成功抑制了p115RhoGEF表達，在此基礎上予TNF－α刺激，30 min后RhoA活化較對照組明顯降低，提示抑制p115RhoGEF可以部分阻止TNF－α對RhoA的激活，證實p115RhoGEF參與了TNF－α對RhoA活化的調控。

綜上所述，TNF－α可以誘導小鼠腦微血管內皮細胞RhoA活性增加和表達上調，在一定程度上揭示了TNF－α損傷內皮細胞的機制。

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