菩人丹超微粉對糖尿病大鼠視網膜神經細胞凋亡及相關基因表達的影響

董志軍， 李曉紅， 董微麗， 張鐵民

(承德醫學院附屬醫院眼科，河北承德067000)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病眼部并發癥中嚴重的致盲病變，是導致視力喪失的主要原因［1，2］。以往對DR發病機制的研究主要集中在視網膜新生血管方面。近年的研究表明［3］，DR不僅有視網膜微血管病變，而且早期即存在視網膜神經組織的功能損害，視網膜神經保護治療日益受到關注。本研究旨在通過觀察菩人丹超微粉(Purendan superfine powder，PRD)對糖尿病大鼠視網膜神經細胞凋亡及相關基因表達的影響，探討其對糖尿病大鼠視網膜神經組織的保護作用。

材料和方法

1 材料

1.1 藥物與試劑 菩人丹超微粉由苦瓜、人參、丹參、制首烏、葛根、水蛭組成，河北以嶺藥業集團有限公司代加工生產;鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma;Trizol購自Invitrogen;脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TdT－mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche;B細胞白血病/淋巴瘤相關抗原2(B－cell leukemia/lymphoma 2，Bcl－2)和 B細胞白血病/淋巴瘤相關抗原相關X蛋白(Bcl－associated X，Bax)兔抗多克隆抗體均購自Santa Cruz;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase－3)兔抗多克隆抗體購自Bioworld Technology;bcl－2、bax和 caspase－3引物購自上海生工公司;SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司;RT－PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 動物 清潔級雄性Wistar大鼠［北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號為SCXK(京)2006－0009］，體重200－250g。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備與給藥 將36只大鼠應用隨機數字表法進行完全隨機化分組，分為正常對照組、糖尿病模型組和PRD治療組，每組12只。糖尿病模型組、PRD治療組大鼠均采用2%STZ(25 mg·kg－1·d－1，3 d)連續腹腔注射建立糖尿病動物模型，以血糖≥16.7 mmol·L－1作為成模標準［4］。模型成功建立后，依體表面積折算確定PRD治療組給藥劑量為 1.8 g 超微粉·kg－1·d－1，用蒸餾水配制成濃度為0.25 kg超微粉/L混懸液，按7.2 mL/kg動物體重灌胃，每天灌胃1次，連續灌胃3個月。正常對照組及糖尿病模型組按7.2 mL/kg動物體重用蒸餾水灌胃。

2.2 標本制備 PRD治療結束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g·kg－1)大鼠，迅速取出雙側眼球，一側眼球浸于4%多聚甲醛固定液24 h，常規脫水、透明、浸蠟和包埋，分別備用于TUNEL法原位檢測細胞凋亡及免疫組織化學染色檢測Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白表達;另一側眼球迅速利用動物手術顯微鏡在冰面上鈍性分離視網膜組織，投入液氮中保存，備用于RT－PCR法檢測bcl－2、bax、caspase－3 mRNA表達。

2.3 TUNEL法原位檢測細胞凋亡 石蠟切片常規脫蠟至水，proteinase K工作液消化15 min，TUNEL反應液37℃孵育60 min，過氧化物酶(peroxidase，POD)轉化劑37℃孵育30 min，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。凋亡細胞的細胞核呈棕褐色著染。凋亡指數(apoptotic index，AI)的確定:切片在×400顯微鏡下選取視網膜，以TUNEL陽性細胞數目與同一視野神經細胞總數的比值作為視網膜神經細胞凋亡指數。每只動物任選3張切片，每張切片選取5個視野，取平均值。

2.4 免疫組織化學染色檢測Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達 眼球平行視神經連續矢狀切片，片厚4 μm，采用SP免疫組織化學染色方法檢測視網膜Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達。Ⅰ抗分別為Bcl－2、Bax和caspase－3多克隆抗體，稀釋濃度為1∶100，DAB 顯色，蘇木素復染細胞核。以0.01 mmol·L－1PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。Bcl－2和Bax以胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性反應，caspase－3以胞核中出現棕黃色顆粒為陽性反應。采用MiVnt圖像分析系統對免疫組化陽性結果進行定量分析:切片在×400顯微鏡下選取視網膜，以免疫陽性產物面積占視野面積的比值作為目的蛋白的相對表達水平。每只動物任選3張切片，每張切片選取5個視野，取平均值。

2.5 RT－PCR 檢測視網膜 bcl－2、bax和 caspase－3 mRNA表達 取液氮中保存的視網膜，按Trizol總RNA抽提說明書操作，提取視網膜組織的總RNA。取5 μL RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見明顯的28 S、18 S和5 S三條完整條帶，說明抽提的總RNA比較完整;紫外分光光度計檢測A260/A280值為1.9－2.1，說明RNA沒有被污染。取3 μg總RNA為模板逆轉錄成cDNA，反應條件為:30℃10 min;55℃30 min;99℃5 min;5℃5 min。PCR反應條件:94℃2 min;94℃30 s;50℃ －65℃30 s;72℃1 min，第2步起循環。bcl－2引物序列為:正義鏈5'－TGGGATGCCTTTGTGGAACTAT－3'，反義鏈5'－GCTGATTT-GACCATTTGCCTGA －3'，退火溫度為 55℃，30 個循環，產物大小為328 bp;bax引物序列為:正義鏈5'－GAGCGAGTGTCTCCGGCGAATT－3'，反義鏈 5'－GCCACAAAGATGGTCACTGTCTGC －3'，退火溫度為59℃，31個循環，產物大小為357 bp;caspase－3引物序列為:正義鏈5'－ATGTCGATGCAGCTAACCTCA －3'，反義鏈 5'－ TGTCTCAATACCGCAGTCCAG－3'，退火溫度為53℃，31個循環，產物大小為320 bp;β－actin引物序列為:正義鏈 5'－CATCCTGCGTCTGGACCT－3'，反義鏈 5'－ TCAGGAGGAGCAATGATCTTG－3'，退火溫度為58℃，29個循環，產物大小為480 bp。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝初像，并用Quantity One－4.6.2軟件進行定量分析，以目的條帶的光密度與β－actin條帶吸光度的比值作為各目的基因mRNA表達的相對水平。

3 統計學處理

結 果

1 視網膜原位凋亡細胞檢測結果

各組大鼠視網膜切片均可見TUNEL陽性染色。TUNEL陽性產物位于胞核，呈棕褐色顆粒狀，陽性細胞主要分布于視網膜神經節細胞層及內核層，呈散在分布。模型組大鼠視網膜神經細胞AI較正常組明顯升高(P＜0.01);PRD治療組大鼠視網膜神經細胞AI較模型組顯著降低(P＜0.01)，見表1、圖1。

表1 各組大鼠視網膜神經細胞凋亡指數Table 1.Apoptotic index(AI)of retina in each group(±s.n=12)

表1 各組大鼠視網膜神經細胞凋亡指數Table 1.Apoptotic index(AI)of retina in each group(±s.n=12)

＊＊ P ＜0.01 vs diabetes model group.

Group AI Normal control 0.0236 ±0.0043＊＊Diabetes model 0.2244 ±0.0263 PRD treatment 0.1171 ±0.0196＊＊

Figure 1.Neuron apoptosis in retina detected by TUNEL staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖1 TUNEL法檢測各組視網膜神經細胞凋亡

2 免疫組織化學法檢測視網膜 Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白表達結果

Bcl－2、Bax和caspase－3免疫陽性產物呈棕黃色細膩顆粒狀，Bcl－2和Bax免疫陽性產物位于胞漿，caspase－3免疫陽性產物位于胞核;陽性細胞主要分布于視網膜神經節細胞層及內核層。糖尿病模型組與正常對照組比較，大鼠視網膜Bax和caspase－3蛋白表達明顯升高(P＜0.01)及Bcl－2蛋白表達、Bcl－2/Bax比值顯著降低(P ＜0.01)。PRD 治療組與模型組比較，大鼠視網膜Bax和caspase－3蛋白表達均明顯降低，Bcl－2蛋白表達及Bcl－2/Bax比值顯著升高(P ＜0.01)，見表2、圖2－4。

3 RT－PCR檢測視網膜bcl－2、bax和caspase－3 mRNA表達結果

在 DNA marker的 328 bp、357 bp、320 bp 及 480 bp水平處分別可見清晰的bcl－2、bax和caspase－3及β－actin mRNA條帶。與正常組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠視網膜bax和caspase－3 mRNA表達明顯升高(P ＜0.01)，bcl－2 mRNA 表達和 bcl－2/bax比值顯著降低(P＜0.01)。PRD治療組與模型組比較，大鼠視網膜bax和caspase－3 mRNA表達均明顯降低(P ＜0.01)，bcl－2 mRNA 表達及 bcl－2/bax比值顯著升高(P ＜0.01)，見表3、圖5－7。

表2 各組大鼠視網膜Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達Table 2.Bcl－2，Bax and caspase－3 protein expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)

表2 各組大鼠視網膜Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達Table 2.Bcl－2，Bax and caspase－3 protein expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs diabetes model group.

Group Bcl－2 Bax Bcl－2/Bax Caspase－3 Normal control 0.0799 ±0.0099＊＊ 0.0397 ±0.0072 ＊＊ 2.0482 ±0.3395＊＊ 0.1036 ±0.0121＊＊Diabetes model 0.0466 ±0.0074 0.0868 ±0.0083 0.5471 ±0.1364 0.3284 ±0.0254 PRD treatment 0.0624 ±0.0088＊＊ 0.0563 ±0.0061 ＊＊ 1.1183 ±0.1972＊＊ 0.1628 ±0.0133＊＊

Figure 2.Bcl－2 protein expression in retina by immunohistochemical staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖2 免疫組織化學染色檢測各組視網膜組織Bcl－2蛋白表達

Figure 3.Bax protein expression in retina by immunohistochemical staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖3 免疫組織化學染色檢測各組視網膜組織Bax蛋白表達

Figure 4.Caspase－3 protein expression in retina by immunohistochemical staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖4 免疫組織化學染色檢測各組視網膜組織caspase－3蛋白表達

表3 各組大鼠視網膜bcl－2、bax和caspase－3 mRNA的表達Table 3.Bcl－2，bax and caspase－3 mRNA expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)

表3 各組大鼠視網膜bcl－2、bax和caspase－3 mRNA的表達Table 3.Bcl－2，bax and caspase－3 mRNA expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)

＊＊ P ＜0.01 vs diabetes model group.

Group Bcl－2 Bax Bcl－2/bax Caspase－3 Normal control 0.7365 ±0.0478＊＊ 0.3256 ±0.0181＊＊ 2.2615 ±0.0435＊＊ 0.1149 ±0.0284＊＊Diabetes model 0.2889 ±0.0310 0.7063 ±0.0274 0.4088 ±0.0349 0.6848 ±0.1003 PRD treatment 0.5252 ±0.0493＊＊ 0.4587 ±0.0602＊＊ 1.1495 ±0.0646＊＊ 0.3867 ±0.0369＊＊

Figure 5.Bcl－2 mRNA expression in retina detected by RTPCR.A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖5 RT－PCR檢測各組視網膜組織bcl－2 mRNA表達

Figure 6.Bax mRNA expression in retina detected by RTPCR.A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖6 RT－PCR檢測各組視網膜組織bax mRNA表達

Figure 7.Caspase－3 mRNA expression in retina detected by RT－PCR.A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖7 RT－PCR檢測各組視網膜組織caspase－3 mRNA表達

討 論

DR包括微血管病變及神經組織病變，二者共同損傷視網膜造成其功能下降。以往對微血管病變的研究較為廣泛和深入，但近年的研究表明，DR不僅存在視網膜神經組織的功能損害，而且常較微血管病變更早，甚至是微血管病變的啟動因素［5，6］。

細胞凋亡是多細胞有機體為調控機體發育，維護內環境穩定，由基因控制的細胞主動性死亡過程。視網膜神經組織病變與細胞凋亡密切相關。Barber等［7］研究發現，病程1個月時STZ糖尿病大鼠視網膜中凋亡的神經細胞為正常對照組的10倍。本研究結果與前人類似:糖尿病模型組大鼠視網膜凋亡的神經細胞主要分布于視網膜的神經節細胞層及內核層，且神經細胞凋亡指數較正常組明顯升高，因此提示視網膜神經細胞凋亡參與了DR的發生發展。

細胞凋亡的發生是在多種凋亡相關基因的調控下進行的，尤其是bcl－2、bax基因與凋亡的調控關系非常密切［8，9］。bcl－2是一種抑制細胞凋亡的基因，bax基因與bcl－2基因具有高度的同源序列，是促進細胞凋亡的基因［10］。當bax占優勢時，Bax蛋白同源二聚體形成，可誘導和促進細胞凋亡;當Bcl－2占優勢時，Bcl－2可以與Bax競爭結合，形成比Bax/Bax同源二聚體更穩定的Bcl－2/Bax異源二聚體，從而使Bax/Bax同源二聚體分開，減弱Bax誘導凋亡的作用［11］。Bcl－2與Bax的平衡保證細胞的穩態，二者比值的變化將決定細胞是生存還是凋亡，Bcl－2占優勢、Bcl－2/bax比值升高則細胞存活;Bax占優勢、Bcl－2/Bax 降低則細胞凋亡［12］。Caspase－3又被稱為“細胞死亡執行者”，它的表達與活化代表了細胞凋亡的不可逆轉。活性caspase－3可直接水解細胞的重要結構及功能蛋白，導致蛋白酶級聯反應放大效應，最終導致細胞凋亡［13］。本研究發現，糖尿病模型組大鼠視網膜 Bcl－2、Bax及caspase－3蛋白表達主要位于神經節細胞層和內核層，與正常對照組比較，Bax、caspase－3表達明顯升高，Bcl－2表達及Bcl－2/Bax比值顯著降低，提示Bcl－2、Bax、caspase－3 確實在 DR 視網膜神經細胞凋亡中發揮了關鍵作用。

菩人丹超微粉(PRD)是針對糖尿病病機關鍵“熱、虛、瘀”的中藥組方。本方以苦瓜(《廣東新語》又稱菩達)清解郁熱;人參、丹參、葛根益氣生津、活血化瘀;制首烏補益精血，固腎益陰;水蛭祛瘀消癥，剔邪搜絡。諸藥協同，益氣養陰，調暢氣血，化瘀通絡。現代藥理研究證實PRD具有抑制氧化應激、對抗細胞凋亡失調和衰老、改善微循環、促進組織的修復與再生等作用［14，15］。本研究發現，PRD組大鼠視網膜神經細胞AI、Bax、caspase－3的表達明顯低于模型組大鼠，Bcl－2表達及Bcl－2/Bax比值較模型組顯著升高。這表明PRD可通過上調抑制凋亡基因bcl－2表達、下調促凋亡基因bax表達，抑制caspase－3的激活，從而抑制視網膜神經細胞凋亡，發揮對視網膜神經組織的保護作用。

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