缺氧后處理中CYP2J3/EETs系統(tǒng)對(duì)心肌凋亡的影響*

趙艷芝， 張冬梅， 于剛剛， 曾翔俊， 王紅霞， 蘆玲巧， 張立克， 王巖梅△

(1首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院生理與病理生理教研室，北京101300;2首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，北京100069)

隨著抗缺血/再灌注損傷(ischemic/reperfusion，I/R)心肌自身保護(hù)研究的不斷深入，近年來提出了缺血后處理(ischemic postconditioning，IPo)的概念［1］。大量研究證實(shí)缺血后處理具有縮小心肌梗死范圍［2］、減輕內(nèi)皮功能損傷、抗再灌注心律失常、改善心肌代謝及收縮和舒張功能、減輕超微結(jié)構(gòu)的破壞等心肌保護(hù)作用［3］，減輕細(xì)胞凋亡［4］。缺血后處理對(duì)心臟再灌注的干預(yù)發(fā)生在缺血后，比缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IPc)有明顯的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，故后處理越來越受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。但后處理通過怎樣的機(jī)制減輕缺血/再灌注損傷?通過哪種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式發(fā)揮保護(hù)作用?尚不明了。通過在體及離體實(shí)驗(yàn)我室前期工作已證明缺血后處理與細(xì)胞色素P450表氧化酶2J3/環(huán)氧二十碳三烯酸系統(tǒng)(cytochrome P450 2J3/epoxyeicosatrienoic acids，CYP2J3/EETs)上調(diào)密切相關(guān)［2，5］。鑒于 11，12 －EET具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用［6］，IPo是否通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng)，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡而保護(hù)心肌?值得探討。本工作通過觀察干預(yù)內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)對(duì)缺氧后處理(hypoxia postconditioning，HPost)心肌細(xì)胞凋亡蛋白的影響，了解缺氧后處理上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng)后發(fā)揮心臟保護(hù)的可能作用途徑。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 胰蛋白酶(Hyclone)、膠原酶Ⅰ、Ⅱ(Sigma)、絲裂霉素 C(Roche)、DMEM(Hyclone);環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)純品及空白對(duì)照(Sigma)、無水乙腈(Fisher Scientifid)、甲酸(Sigma－Aldrich Chemic GmbH，Riedstr)、N，N －diisopropylethy lamine(Sigam)、固相提取柱(Waster Corporation);caspase－3活性檢測(cè)試劑盒(Roche)、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天試劑公司)、caspase－3抗體(Santa Cruz)、Western blotting發(fā)光試劑盒(Pierce);DMSO(Sigma);細(xì)胞色素P450表氧化酶抑制劑6－(2－炔丙基氧苯基)己酸［6－(2－propargyloxyphenyl)hexanoic acid，PPOH］(Sigma);pcDNA3.12－CYP2J3質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 主要儀器 超速低溫離心機(jī)(Sigma)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Revco)、酶標(biāo)儀(Labsystems)、低溫冰箱(Sanyo)。

1.3 動(dòng)物 Wistar乳鼠(12－24 h)由首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。

2 方法

2.1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及缺氧/復(fù)氧(H/R)模型復(fù)制 取Wistar乳鼠(12－24 h)心臟做原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)［7］。碘酒及乙醇消毒乳鼠胸腹部，開胸取其心臟的心室部分放入含PBS的燒杯內(nèi)沖洗2次，洗凈血液后剪碎心臟成1 mm×1 mm ×1 mm，各加5 mL 1.25 g/L胰酶、1 g/L膠原酶Ⅰ、0.5 g/L膠原酶Ⅱ，37℃水浴消化(加轉(zhuǎn)子)4 min，首次消化液去掉，后5次消化液收集，按1∶1混合20%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(含青－鏈霉素100 mg/L)終止消化。用80目篩網(wǎng)過濾1次，配平后1 000 r/min離心10 min棄去上清，加完全培養(yǎng)基至24 mL，吹打均勻，放入1個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入絲裂霉素C(2 kg/L)抑制成纖維細(xì)胞增殖，20 min、37℃培養(yǎng)，差速貼壁去掉成纖維細(xì)胞。免疫組化方法α－action染色鑒定心肌細(xì)胞。

將細(xì)胞放入自制的缺氧罐內(nèi)，通入混合氣體(O22%，CO25%，N293%)3 h后再將細(xì)胞取出，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧2 h。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 (1)對(duì)照組(control):細(xì)胞用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，不經(jīng)任何處理，繼續(xù)培養(yǎng)5 h;(2)缺氧/復(fù)氧組(H/R):按上述方法進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理;(3)缺氧后處理組(HPost):心肌細(xì)胞缺氧3 h后，采用缺氧罐內(nèi)5 min、復(fù)氧5 min重復(fù)3次的方法進(jìn)行后處理，再繼續(xù)復(fù)氧85 min;(4)空質(zhì)粒組:按照 2 μg pcDNA3.12 質(zhì)粒/1×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后處理同HPost組;(5)CYP2J3 轉(zhuǎn)染組:按照 2 μg pcDNA3.12－CYP2J3質(zhì)粒/1×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后處理同HPost組;(6)DMSO溶劑組:按照3 μL DMSO/L培養(yǎng)液進(jìn)行抑制，加入DMSO 24 h后處理同HPost組;(7)PPOH組:按照3μL PPOH/L培養(yǎng)液進(jìn)行抑制，24 h后處理同HPost組。

3 觀察指標(biāo)

3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力［8］取96孔培養(yǎng)板中各組細(xì)胞，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心棄去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL，微量振蕩器上震搖10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀490 nm下測(cè)定各孔吸光度值(A)。

3.2 高效液相色譜法(high－performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度［9］對(duì)心肌組織進(jìn)行處理和衍生后上機(jī)檢測(cè)樣品，流動(dòng)相:A相0.5%甲酸水溶液，B相0.5%甲酸乙腈溶液，流速1 mL/min，層析條件:前40 min B相濃度由50%增至65%，其后80 min B相濃度由65%增至100%，最后以B相100%維持20 min。

3.3 心肌細(xì)胞caspase－3蛋白含量 提取細(xì)胞蛋白，按BCA蛋白定量試劑盒說明書定量蛋白，采用Western blotting方法測(cè)定各組細(xì)胞caspase－3蛋白表達(dá)變化。

3.4 心肌細(xì)胞caspase－3蛋白活性測(cè)定 提取心肌細(xì)胞蛋白，按Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天試劑公司)說明書定量蛋白，采用caspase－3蛋白活性檢測(cè)試劑盒按照說明書測(cè)定caspase－3蛋白活性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞在光鏡下呈棱型或多角形伸展，中間較厚，逐漸形成細(xì)胞簇或細(xì)胞單層，可自然搏動(dòng)，頻率約為50次/min;用抗肌動(dòng)蛋白αactin的單克隆抗體鑒定心肌細(xì)胞呈陽性，陽性率達(dá)95%，胞漿呈淡棕色，清晰可見心肌細(xì)胞肌絲結(jié)構(gòu)，見圖 1、2。

2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

H/R組心肌細(xì)胞活力明顯低于control組(P＜0.01)，HPost組心肌細(xì)胞活力高于 H/R組(P＜0.01)，PPOH組心肌細(xì)胞活力明顯低于 HPost組(P＜0.01)，CYP2J3組心肌細(xì)胞活力明顯高于HPost組(P＜0.01)。PPOH組與DMSO組之間差異顯著(P＜0.05)，CYP2J3組與空質(zhì)粒組之間也有顯著差異(P ＜0.01)，見圖3。

Figure 1.Cultured neonatal rat cardiac myocytes(×200).圖1 培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞

Figure 2.Identification of cultured neonatal rat cardiac myocytes with immunohistochemical staining using antibody to α－actin(×200).圖2 乳鼠心肌細(xì)胞鑒定

Figure 3.The effects of CYP2J3/EETs system on livability of cardiac myocytes.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲P＜0.05 vs PPOH group;○○P ＜0.01 vs CYP2J3 group.圖3 CYP2J3/EET系統(tǒng)對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響

3 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度的變化

采用HPLC檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H/R組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度低于對(duì)照組(P＜0.01)，HPost組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度明顯高于H/R組(P＜0.01)，PPOH抑制劑組明顯低于 HPost組(P＜0.01)，CYP2J3轉(zhuǎn)染組明顯高于 HPost組(P＜0.01)。PPOH組與DMSO組之間有顯著差異(P＜0.01)，CYP2J3組與空質(zhì)粒組之間也有顯著差異(P＜0.01)，見圖4。

4 心肌細(xì)胞caspase－3蛋白含量的變化

H/R組心肌細(xì)胞內(nèi)caspase－3蛋白的表達(dá)比對(duì)照組高(P＜0.05)，HPost組心肌細(xì)胞內(nèi)caspase－3蛋白的表達(dá)明顯低于H/R組(P＜0.01)，CYP2J3轉(zhuǎn)染組蛋白的表達(dá)明顯低于 HPost組(P＜0.01)，PPOH組蛋白的表達(dá)高于 HPost組(P＜0.01)。PPOH組于 DMSO組之間差異顯著(P＜0.01)，CYP2J3組與空質(zhì)粒組之間也有顯著差異(P＜0.05)，見圖 5。

5 心肌細(xì)胞caspase－3蛋白活性

H/R組心肌細(xì)胞內(nèi)caspase－3蛋白活性比對(duì)照組高(P＜0.01)，HPost組心肌細(xì)胞內(nèi)caspase－3蛋白活性明顯低于H/R組(P＜0.01)，空質(zhì)粒組活性明顯高于HPost組(P＜0.01)，CYP2J3轉(zhuǎn)染組活性明顯低于空質(zhì)粒組(P＜0.01)，PPOH組活性高于HPost組(P＜0.01)。PPOH組于DMSO組之間差異顯著(P ＜0.01)，見圖6。

Figure 4.The alterations of 11，12 － EET concentration in cardiomyocyte culture medium.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;Empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲▲P ＜0.01 vs PPOH group;○○P ＜0.01 vs CYP2J3 group.圖4 心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度的變化

Figure 5.The expression of caspase－3 protein in cardiomyocytes.The caspase－3 protein levels were normalized to β － actin.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+ HPost as above;with CYP2J3:transfected CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;##P ＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲P ＜0.05 vs PPOH group;○P ＜0.05 vs CYP2J3 group.圖5 心肌細(xì)胞caspase－3蛋白表達(dá)的變化

討 論

Zhao等［1］提出缺血后處理的概念后，研究已證實(shí)缺血后處理(IPo)有著與缺血預(yù)處理相似的心臟保護(hù)作用，包括減少心肌梗死面積［2］、減少再灌注心律失常的發(fā)生等。但是缺血后處理的保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。近年來，內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)在缺血后處理中的作用引起關(guān)注。我室前期工作證實(shí)，CYP2J3/EETs系統(tǒng)上調(diào)可能是缺血后處理獨(dú)特的保護(hù)機(jī)制之一［2］。

CYP2J3作為細(xì)胞色素P450表氧化酶(cytochrome P450 epoxygenase)的一個(gè)亞型，主要存在于大鼠的肝臟和心臟中。EETs是花生四烯酸經(jīng)CYP450表氧化酶代謝的產(chǎn)物，包括5，6 －EET、8，9 － EET、11，12 － EET、14，15 － EET［10］。近年來CYP2J3/EETs系統(tǒng)對(duì)心血管系統(tǒng)的調(diào)控作用引起關(guān)注。我室前期通過在體及離體實(shí)驗(yàn)證明，缺血后處理增加心臟CYP2J3表達(dá)及11，12－EET水平，可能是拮抗心臟再灌注損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一［2、5］。IPo導(dǎo)致的 CYP2J3/EET 系統(tǒng)上調(diào)參與心肌保護(hù)的機(jī)制尚不清楚。鑒于IPo抑制心肌細(xì)胞凋亡，且EETs也可抑制細(xì)胞凋亡［6］，IPo是否通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng)，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡而保護(hù)心肌的問題值得探討。

Figure 6.The alterations of caspase－3 activity in cardiomyocytes.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.*P＜0.05 vs control group;##P＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲▲P ＜0.01 vs empty vector group;○○P ＜ 0.01 vs PPOH group.圖6 心肌細(xì)胞內(nèi)caspase－3蛋白活性的變化

PPOH是細(xì)胞色素P450表氧化酶的特異抑制劑［11］，因?yàn)樗械谋江h(huán)基團(tuán)可以和表氧化酶緊密結(jié)合，除了這個(gè)苯環(huán)以外PPOH化學(xué)結(jié)構(gòu)含有末端乙炔基團(tuán)，正是這個(gè)基團(tuán)可以導(dǎo)致表氧化酶自殺式的抑制［12］，實(shí)驗(yàn)證明PPOH末端的乙炔基團(tuán)不僅可以使細(xì)胞色素P450表氧化酶血紅素基團(tuán)烷化，也可以使表氧化酶的表達(dá)下降［11］。這些特點(diǎn)使PPOH能抑制CYP2J的表達(dá)及活性，成為CYP2J的特異抑制劑。心肌中CYP450亞型主要是2J2(CYP2J2，人心臟為主)和2J3(CYP2J3，大鼠心臟為主)。所以本實(shí)驗(yàn)選擇PPOH作為CYP2J3的抑制劑來干預(yù)CYP2J3/EET系統(tǒng)。

本實(shí)驗(yàn)觀察到H/R組心肌細(xì)胞存活率低于對(duì)照組(P＜0.01)，提示缺氧/復(fù)氧可導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，HPost組心肌細(xì)胞存活率低于缺氧/復(fù)氧組(P＜0.01)，提示HPost組可以拮抗缺氧/復(fù)氧損傷，而對(duì)缺血心肌起保護(hù)作用，與他人實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［1，2，5］。我們對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn) H/R 組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度比CON組下降(P＜0.01)，而缺氧后處理組11，12－EET濃度高于缺氧/復(fù)氧組(P＜0.01)，在細(xì)胞水平上證明缺氧后處理有可能通過內(nèi)源性11，12－EET的上調(diào)而對(duì)心肌有保護(hù)作用，這與本室在體及離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［2，5］。進(jìn)而我們對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行 CYP2J3外源基因轉(zhuǎn)染，結(jié)果提示基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率高于HPost組(P＜0.01)，同時(shí)11，12 － EET濃度也高于HPost組(P＜0.01)，提示轉(zhuǎn)染的 CYP2J3基因進(jìn)行表達(dá)，通過分解花生四烯酸，使11，12－EET濃度增加，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。綜上所述提示缺氧后處理有可能是通過提高內(nèi)源性CYP2J3的表達(dá)，進(jìn)而分解花生四烯酸，提高11，12－EET濃度，從而對(duì)心肌起保護(hù)作用。

在PPOH抑制劑組心肌細(xì)胞存活率和11，12－EET濃度相比缺氧后處理組明顯降低(P＜0.01)，提示心肌細(xì)胞內(nèi)源性CYP2J3被抑制后，導(dǎo)致11，12－EET濃度下降，減弱了EET對(duì)心肌的保護(hù)作用。從反面進(jìn)一步證明了缺血后處理組有可能是通過提高內(nèi)源性CYP2J3的表達(dá)，進(jìn)而提高11，12－EET濃度而對(duì)心肌起保護(hù)作用。

研究認(rèn)為，心肌細(xì)胞凋亡是多種因素引起的心肌細(xì)胞死亡的主要機(jī)制［13］。Caspases蛋白的激活是心肌細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵現(xiàn)象［14］。其中caspase－3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，也是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子和最重要的執(zhí)行者［15－17］。心肌缺血/再灌注促進(jìn)凋亡蛋白caspase－3激活，導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡可能是缺血/再灌損傷的早期病理改變［18，19］。鑒于 IPo 抑制心肌細(xì)胞凋亡［1］，且 EETs也可抑制細(xì)胞凋亡［6］，IPo是否通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng)，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡而保護(hù)缺血/再灌心肌?本實(shí)驗(yàn)中H/R組caspase－3蛋白表達(dá)(P＜0.05)及活性(P＜0.01)均高于對(duì)照組，細(xì)胞存活率低于對(duì)照組(P＜0.01)，表明缺氧/復(fù)氧損傷可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，與其它實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［20］。HPost組 caspase－3蛋白表達(dá)及活性均低于H/R組(P＜0.01)，提示缺氧后處理可以拮抗缺氧/復(fù)氧損傷導(dǎo)致的caspase－3蛋白表達(dá)增加而抑制細(xì)胞凋亡。CYP2J3轉(zhuǎn)染組caspase－3蛋白表達(dá)及活性均低于H/R組(P＜0.01)，且轉(zhuǎn)染CYP2J3組心肌細(xì)胞存活率也高于H/R組(P＜0.01)，表明CYP2J3高表達(dá)可能通過降低caspase－3蛋白表達(dá)、降低caspase－3蛋白活性來抑制細(xì)胞凋亡，從而對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。PPOH抑制劑組caspase－3蛋白表達(dá)及活性均高于HPost(P＜0.01)，從反向進(jìn)一步證明了心肌細(xì)胞內(nèi)源性CYP2J3被抑制后，減弱了 CYP2J3/EET系統(tǒng)對(duì)caspase－3蛋白表達(dá)及活性的抑制，促進(jìn)了心肌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，缺氧后處理有可能通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng)，來降低caspase－3蛋白的表達(dá)及其活性從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，達(dá)到心肌細(xì)胞保護(hù)作用。鑒于細(xì)胞凋亡分線粒體途徑和死亡受體途徑2條途徑，IPo導(dǎo)致的CYP2J3/EET系統(tǒng)上調(diào)究竟通過哪條途徑來抑制細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，值得進(jìn)一步探討。

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