小鼠骨髓來源內皮祖細胞體外誘導培養及分化特征*

武 鈞， 李建芳， 瞿 穎， 陳雪華， 湯耀卿△

(1上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院SICU，2上海市消化外科研究所，上海200025)

自 Asahara等［1］發現內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)以來，EPCs成為新生血管生成研究領域的焦點，其在血管內皮損傷修復方面有廣闊的應用前景。分離和體外穩定培養EPCs，了解其分化的生物學特性是進行相關機制和應用研究的基礎［2］。已有較多人源EPCs培養和分化特征的研究，而小鼠EPCs體外培養及分化特性的研究較少，本研究旨在探索小鼠骨髓來源EPCs的培養方法，詳細觀察其體外分化特征，為相關深入研究奠定基礎。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康雄性BALB/c小鼠(8－12周，16－25g)購自上海BK實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑 vWF單克隆抗體和FITC標記的驢抗兔IgG購自Abcam;CD31和VE－cadherin單克隆抗體購自BD Biosciences;EGM－2培養液和EGM SingleQuot購自Clonetics;流式細胞技術所需熒光標記的單克隆抗體及同型對照均購自eBioscience;特級胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Hyclone;DiI標記的乙?；兔芏戎鞍?DiI－acLDL)購自Molecular Probes;內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)多克隆抗體、大鼠IgG和兔IgG購自Santa Cruz;生長因子及其它實驗中所需試劑均購自Sigma。

2 方法

2.1 小鼠骨髓單個核細胞的分離與培養 頸椎脫臼法處死小鼠，嚴格無菌狀態下分離股骨和脛骨，用含10%FBS的RPMI－1640培養液反復輕柔沖洗骨髓腔，收集單細胞懸液，用Histopaque－1083并采用梯度離心法收集骨髓單個核細胞，用0.2%臺盼藍染液進行細胞計數和活力鑒定。將細胞以2×106cells/well接種于預先包被纖維結合蛋白的6孔板內，加入EGM －2 完全培養液，于37°C、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養。24 h后棄貼壁細胞并繼續培養懸浮細胞，4 d后棄懸浮細胞，繼續培養貼壁細胞，以后每2 d更換1次培養液。待細胞生長至70%呈融合狀態時，每孔加入1 mL 0.25%胰酶，于37°C下消化并收集細胞，1∶2比例接種于培養板內繼續培養。

2.2 流式細胞儀檢測 分別于培養前、培養4 d、7 d、10 d、14 d用流式細胞技術對細胞表面或胞漿抗原進行檢測，主要檢測CD133、CD117、干細胞抗原－1(stem cell antigen 1，SCA －1)、CD31、vWF、eNOS、VE－cadherin、血管內皮生長因子受體－2(vascular endothelial growth factor receptor－2，VEGFR －2)以及CD45。

2.3 免疫熒光檢測 培養7 d時，通過免疫熒光檢測培養細胞 CD133、CD117、SCA － 1、CD31、vWF、eNOS、VE－cadherin和VEGFR－2的表達狀況。

2.4 吞噬acLDL和結合荊豆凝集素(Ulex europaeus agglutinin I，UEA－I)能力檢測

①免疫熒光檢測 在培養液中以2.5 mg/L加入DiI－acLDL，培養 4 h后沖洗去除未吞噬的 DiI－acLDL，4%多聚甲醛固定細胞后以1∶20加入FITCUEA－I，室溫下孵育1 h，洗滌后DAPI復染細胞核。DiI－acLDL被吞噬后使胞漿呈紅色，FITC－UEA－I結合到細胞使胞膜呈綠色，雙陽性細胞為2種顏色的重疊，在熒光纖維鏡下呈橙黃色。

②流式細胞檢測 在培養液中以2.5 mg/L加入DiI－acLDL，培養4 h后PBS洗滌以去除未吞噬的DiI－acLDL，胰酶消化并收集細胞，PBS洗滌后以1∶20加入FITC－UEA－I，室溫孵育1 h，PBS洗滌后2%多聚甲醛固定細胞并上機進行檢測。

2.5 EPCs增殖和遷移能力檢測 培養7 d后，分別采用MTT和Transwell方法對培養細胞在不同濃度VEGF下的增殖和遷移能力進行檢測。

3 統計學處理

結 果

1 骨髓來源EPCs的誘導培養和生長狀況

細胞培養2 d后細胞開始變大和不規則，細胞核分裂相增多，并開始貼壁生長。3 d后可見快速分裂的細胞形成小的集落(圖1A)，中間為圓形細胞，邊緣少量細胞伸展呈梭形，此時的克隆樣生長還不太明顯，細胞體積小，伸展不是很完全，貼壁細胞多為梭形或橢圓形，部分呈線樣生長(圖1B)，其間混有少量紡錘形細胞，這類細胞增殖能力低，培養過程中其數量基本保持不變。第7 d，貼壁細胞形成的集落明顯增多(圖1C)，集落多由幾十個或上百個細胞組成，集落內細胞開始向外放射狀生長，形成典型的放射狀集落(圖1D)。10 d左右細胞基本融合，呈片狀生長(圖1E)，部分細胞首尾相連形成內皮細胞特異性索條狀結構(圖1F)。14 d左右，細胞長滿培養板底部，單層細胞呈多角形融合成片狀，形成典型的鋪路石樣外觀(圖1G)。將7 d形成克隆的細胞重新接種，7 d后形成具有快速增殖潛能的放射狀集落(圖1H)，這些細胞形成的集落明顯大于早期形成的集落，常由上千個細胞組成，其增殖速度明顯快于早期集落形成細胞。

2 培養分化中的EPCs表型特征的變化

培養7 d后，免疫熒光染色顯示細胞膜CD133、SCA －1、CD117、VEGFR －2、CD31、VE － cadherin 及胞漿eNOS、vWF均為陽性，見圖2。

Figure 1.Morphology of bone marrow mononuclear cells cultured in EGM －2 medium.After 4 d，mononuclear cells formed small colonies(A，×100)and grew in line(B，×100).After 7 d，cultur cells formed typical colonies(C，×40)，the colonies consist of a central cluster of round cells surrounded by radiating，thin and flat cells(D，×100).Cultured cells had high proliferation capacity(E，×40)and formed cord－like structure(F，×100).Cultured cells displayed endothelial cobblestone appearance at day 14(G，×100).Colony cells were re－plated at day 7.Adherent cells formed colonies with high proliferation capacity after 7 d(H，×100).圖1 骨髓來源單個核細胞體外培養時形態學變化

Figure 2.Immunofluorescence identification of EPCs markers after 7 d of culture.圖2 免疫熒光檢測分化中EPCs表面及胞漿抗原表達情況

流式分析顯示(圖3)，新分離的骨髓單個核細胞CD133、SCA－1、CD117的表達率分別為0.16%、2.94%、1.26%，而4 d后貼壁細胞的表達分別達到11.05%、29.32%及16.45%，此后隨著培養時間延長三者的表達率逐漸下降，至14 d其分別下降至2.29%、7.82%和3.92%;而細胞表面VEGFR－2、CD31、VE－cadherin及胞漿 eNOS、vWF在新分離細胞中的表達率分別為 0.24%、0.13%、1.55%、0.05%和0.61%，4 d后其表達明顯增加，分別達到12.21%、8.43%、18.27%、7.11%和 32.61%，此后其表達逐步增加，至14 d其表達率分別達到62.13%、32.96%、67.73%、27.89%和82.16%。隨著培養時間延長，白細胞通用抗原CD45的表達不斷下降，培養前其表達率為54.19%，而培養14 d后其表達率僅為8.15%。

3 EPCs吞噬acLDL和結合UEA－I能力的變化

免疫熒光顯示培養7 d后細胞可吞噬低密度脂蛋白及結合植物凝集素(圖4A)，培養4 d后雙陽性細胞達到57.18%，而14 d后為86.70%(圖4B)，此后雙陽性細胞數量保持相對穩定。

Figure 3.Time course of the expression of CD133，SCA －1，CD117，VEGFR －2，CD31，VE －cadherin，eNOS，vWF and CD45 by FACS analysis in bone marrow mononuclear cells.圖3 培養細胞表型標志物表達狀況的動態變化

Figure 4.The ability of uptaking acLDL and binding UEA－I in EPCs.A:immunofluorescence identification showed EPCs uptaking DiI－acLDL and binding FITC－UEA－I after 7 d of culture(×200);B:time course of EPCs uptaking DiI－acLDL and binding FITC－UEA－I analyzed by FACS.圖4 培養細胞吞噬DiI－acLDL及結合FITC－UEA－I能力的變化

4 EPCs增殖和遷移能力的變化

通過在培養液中加入不同濃度VEGF，結果發現10 μg/L的 VEGF即可明顯促進 EPCs的增殖(圖5A)，隨著VEGF的濃度增加，其增殖能力不同程度提高，80 μg/L VEGF可提高其增殖率約58%。隨著VEGF濃度增加，其對EPCs的遷移和趨化作用明顯增強(圖5B)。

Figure 5.Effects of VEGF on EPCs proliferation and migration capacities.A:effects of VEGF on EPCs proliferation rate.*P ＜0.05 vs 0 μg/L and 5 μg/L group;△P ＜0.05 vs other groups.B:effects of VEGF on EPCs migration capacity.*P ＜0.05 vs 0 μg/L group;△P ＜0.05 vs 0 μg/L，5 μg/L and 10 μg/L group;#P ＜0.05 vs other groups.圖6 VEGF對EPCs增殖及遷移能力的影響

討 論

骨髓單個核細胞是多種細胞的混合群，EPCs本身缺乏特異性表面標志物［3］，所以到目前為止，沒有一種簡單、明確的EPCs分離方法，目前報道的EPCs分離方法主要有免疫磁珠法和差時貼壁法。我們在前期實驗條件摸索過程中發現，通過免疫磁珠分離的小鼠骨髓CD117+細胞生長并不令人滿意，培養2周所得細胞數量有限，這可能與分離過程中磁性微粒對細胞代謝功能產生的影響有關。Asahara在EPCs體外培養研究時發現MNCCD34+(CD34+的單個核細胞)與MNCCD34－(CD34－的單個核細胞)混合培養可以比MNCCD34+單獨培養獲得更多的EPCs［1］，這表明不同細胞系間相互作用或產生的可溶性因子對于EPCs的增殖分化起著重要作用，作為滋養細胞的間充質細胞、成骨細胞等在體外培養環境中對EPCs分化起輔助作用。本研究中利用EPCs貼壁緩慢的特點，采用差時貼壁法去除貼壁能力強的基質細胞、巨噬細胞以及不貼壁的造血細胞，結合纖維連接蛋白的促黏附作用，可獲得較多數量和較高純度的EPCs，培養7－14 d所得細胞數可達到進一步研究的需要。

EPCs培養需要特殊的培養基，目前研究多采用內皮細胞基礎培養基，如DMEM、MEM、M199等，添加內皮細胞生長因子，如VEGF、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰島素樣生長因子－1(insulin－like growth factor 1，IGF－1)等。目前尚未有一種標準成熟的EPCs培養方法，生長因子在培養基中的濃度也各不相同［4］。對于小鼠骨髓來源EPCs的培養目前報道的方法較少，我們在預實驗中采用EGM－2培養基，同時加入包含各種生長因子(EGF、VEGF、bFGF 和 IGF －1)的 SingleQuot，但是發現培養效果并不滿意。經過嘗試，我們發現培養液臨用前適當加入 VEGF、EGF、bFGF(均為10 μg/L)可獲得滿意的培養效果，同時選擇優質FBS對于細胞生長也非常重要。這說明小鼠骨髓來源EPCs培養條件要求比較高，采用EGM－2培養基并加入適當濃度、活性正常的生長因子可在體外穩定培養小鼠EPCs。

自培養的第4 d開始，細胞開始呈現集落生長，這與文獻報道的胚胎時期“血島”樣簇狀生長相類似［5］。隨后細胞數量增多，細胞相互之間逐漸交聯，有些細胞首尾相連呈線狀生長，提示EPCs可排列成管狀，最終形成血管。培養至10－14 d，貼壁細胞基本融合，細胞呈現典型的內皮細胞形態－鵝卵石狀。第4 d，在棄去懸浮細胞后，貼壁細胞SCA－1、CD117及CD133的表達明顯增加，這與差時貼壁及纖維連接蛋白對EPCs的篩選效應有關，隨著體外培養時間的延長其表達率逐漸下降，同時白細胞通用抗原CD45的表達逐步降低，而內皮特異性抗原標志VEGFR －2、CD31、VE －cadherin、vWF 及 eNOS表達逐漸增加，這表明體外誘導培養的EPCs在逐步失去干細胞特性并向內皮細胞方向分化。

小鼠SCA－1屬于Ly－6多基因家族，其主要表達于造血干細胞及祖細胞［6］。CD117又稱 c－Kit，是具有酪氨酸激酶活性的蛋白質分子，是干細胞因子的受體，在早期分化的造血干/祖細胞表面均有表達，轉導了造血干/祖細胞生長和分化的所需信號，CD117+細胞為一群包括了不同分化階段干/祖細胞的異質性細胞［7］，結合SCA－1可將細胞進一步分為兩個亞類:CD117+/SCA－1+和 CD117－/SCA－1+細胞。前者在多種造血生長因子聯合刺激后，表現出極強的增殖能力，為相對早期的造血干細胞，不含定向祖細胞，c－Kit+/SCA－1+細胞在VEGF等內皮生長因子的作用下，可以分化成內皮細胞，說明EPCs來源于 CD117+/SCA －1+細胞［8］。CD133 是早期造血干/祖細胞的標志［9］，目前對其功能還不十分了解，多數學者認為人CD34+/CD133+/VEGFR－2+細胞為早期的EPCs，隨著EPCs逐步分化CD133很快消失，而對于小鼠CD117+/SCA－1+/CD133+/VEGFR－2+細胞應當是早期的EPCs。

研究中無論是從形態學還是表型特征變化都展示了EPCs向內皮細胞分化的特征，但是到目前為止仍無法知道EPCs何時完全失去祖細胞特征而分化為成熟內皮細胞，實驗中培養細胞雖然干細胞表型表達在逐步減少，但EPCs的另一重要特性，吞噬acLDL及結合內皮特異性凝集素UEA－I的能力，在培養過程卻無明顯丟失，傳代接種后仍然有很強的集落形成和快速增殖能力，這表明所培養細胞是介于干細胞與內皮細胞之間，具有高分化潛能且處于不同分化階段內皮前體細胞群的混合體。

VEGF是新生血管生成的主要誘導因子［10］，也是誘導內皮細胞系分化的重要誘導因子，可以動員骨髓內EPCs進入循環，并趨化其到達內皮損傷部位，促進其分化為成熟的內皮細胞，參與受損內皮的修復［11］。實驗中可以看到VEGF是小鼠EPCs體外誘導培養不可或缺的重要因子，其可對離體EPCs的增殖和遷移特性產生劑量依賴性的促進作用，另外在體研究也表明VEGF對EPCs的動員和趨化及新生血管形成產生劑量依賴性促進作用［12］。

通過本研究表明，采用差時貼壁法及EGM－2內皮培養基，加入適當生長因子，在體外可以穩定培養小鼠骨髓來源EPCs。體外培養的EPCs逐步向內皮細胞方向分化，其干細胞標志物表達逐步減少，而內皮細胞標志物表達不斷增加。VEGF是EPCs體外誘導培養的重要生長因子，可對其產生明顯的促增殖和遷移效應。

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