參麻益智湯對擬阿爾海默病模型小鼠的治療作用及其機制研究*

趙彥儒， 戚仁斌， 王華東， 張 晶， 陸大祥

(暨南大學醫學院病理生理學系，暨南大學腦科學研究所，國家中藥管理局三級科研實驗室，廣東廣州510632)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種以進行性認知功能障礙和記憶損害為特征的神經退行性疾病，是老年人中最常見的一種癡呆類型，已經成為僅次于心腦血管、腫瘤之后的又一嚴重威脅老年人生命健康的疾病。中藥復方制劑主要從補益氣血、補腎添精、健脾益腎、活血化瘀、清濁化痰等方面對AD進行治療。自擬中藥復方參麻益智湯(Shenma Yizhi decoction，SYD)由丹參、天麻、杜仲、枸杞、五味子和甘草6味中藥組成，其中丹參有活血化瘀的功效，天麻有安神定志、化痰開竅的功效，杜仲、枸杞和五味子有滋養肝腎的功效，甘草有益氣養血的功效［1］。本實驗運用D－半乳糖造成小鼠的亞急性衰老，來模擬AD發病的老年危險因素，同時灌胃三氯化鋁(AlCl3)制備AD模型小鼠［2］，初步研究了不同劑量的SYD對擬AD模型小鼠的防治作用及其機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 雄性昆明種小鼠120只，SPF級，體重(20±2)g，2－3月齡，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號為2008A022。

1.2 藥品及主要試劑 SYD水溶液:含丹參、天麻、杜仲、枸杞、五味子和甘草6味中藥的水煎劑，購于暨南大學附屬第一醫院中藥房。制備:以藥物總體積的8倍量水浸泡45 min，煎沸以后改溫火煎1 h，取煎液;繼用藥物體積5倍量水，先后再煎2次;合并3次煎液;濾過，濾液用溫火濃縮至藥液濃度為0.8g/L(生藥量)。無菌條件裝瓶，置4℃冰箱備用。實驗時用雙蒸水稀釋成不同濃度(低、中、高劑量質量濃度分別為2、4、8 mg·kg－1·d－1)，依據《中藥藥理學》［3］中的方法確定。Trizol試劑購于 TaKaRa，逆轉錄試劑盒購于 Promega，SYBR? Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒購于 TaKaRa。Caspase－3Ⅰ抗購于Sigma，SA1022兔IgG試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司。SOD試劑盒和MDA試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器 Morris水迷宮視頻追蹤程控系統(成都泰盟生物科技有限公司);ULTRA－TURRAX T8型組織勻漿機(IKA)，低溫高速冷凍離心機(Eppendorf)，多功能全波長酶標儀(Tecan)，梯度 PCR儀(PerkinElmer)，Opticon 2型熒光實時定量PCR儀(MJ Research)，正立電動熒光圖像顯微鏡(Leica)。

2 方法

2.1 動物分組 運用Morris水迷宮將動物分組:平臺置于西北象限的正中，在任一入水點將動物背向平臺放入池中，自由游泳60 s使其適應環境。然后分別從東西南北4個入水點將動物放入池中，記錄其游上平臺所需時間(逃避潛伏期)，讓動物在平臺上休息15 s再進行下1次實驗。淘汰4次均沒有找到平臺的動物，將余下動物以潛伏期成績按隨機區組方法分為6組:空白對照組、AD模型組、SYD低、中、高劑量組(2、4、8 mg·kg－1·d－1)和維生素 E 組(vitamine E，VE，10 mg·kg－1·d－1)，每組 20 只。

2.2 AD小鼠模型的建立和給藥方法 模型組和給藥組腹腔注射D －半乳糖60 mg·kg－1·d－1(生理鹽水配制)和灌胃三氯化鋁5 mg·kg－1·d－1(雙蒸水配置)，連續90 d，空白對照組腹腔注射等量的生理鹽水和灌胃等量的雙蒸水。SYD低、中、高劑量治療組從第51 d開始灌胃相應劑量的SYD，VE組灌胃 VE 10 mg·kg－1·d－1，連續 40 d。

2.3 行為學實驗 －Morris水迷宮測試［4］

①定位航行實驗 反映動物的學習能力，連續4 d，且在水池周圍放置固定參照物，分別從水池東南西北4個入水點將小鼠背向平臺放入水池，電腦記錄小鼠找到并爬上平臺所需的時間，即逃避潛伏期。60 s內找不到平臺者，將其引導上平臺。每游完1次讓小鼠在平臺上休息至少15 s。

②空間探索實驗 反映動物的記憶能力，第5 d。撤走池內平臺，將小鼠從原平臺相對的位置背向平臺放入池中，通過系統記錄并分析小鼠在60 s內的游泳軌跡，計算小鼠經過平臺所在位置的次數和在平臺象限游泳的時間。

2.4 海馬SOD活性和MDA含量檢測 小鼠水迷宮測試結束后，每組隨機取出10只小鼠，迅速斷頭取腦，在冰面上分離兩側海馬組織，按1∶10質量比加入生理鹽水，在冰浴下勻漿30 s，勻漿液在4℃、3 500 r/min離心10 min，吸取上清于－20℃冰凍備用，隔天按試劑盒要求測定SOD活性和MDA含量，采用BCA蛋白測定試劑盒測定腦組織蛋白含量。

2.5 海馬bax和bcl－2 mRNA含量的檢測

①引物的設計與合成 根據GenBank的序列，采用分子生物學分析軟件Primer 5.0設計小鼠以下基因引物，由TaKaRa合成。bax(產物長度為165bp)上游引物 5＇－ CAGGATGCGTCCACCAAGAA － 3＇，下游引物 5＇－ GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA －3＇;bcl－2(產物長度為151 bp)上游引物5＇－TCGCCCTGTGGATGACTGAG －3＇，下游引物 5＇－ AGGCTGAGCAGGGTCTTCAGAG －3＇;GAPDH(產物長度為 275 bp)上游引物 5＇－ TCACCACCATGGAGAAGGC － 3＇，下游引物 5＇－ GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA －3＇。

②海馬RNA樣品的制備 小鼠水迷宮測試結束后，每組隨機取5只小鼠，按Trizol試劑說明書所提供的方法，提取海馬總 RNA，吸取2 μL RNA溶液，滴入微量酶標儀，讀取其在A260/A280處的比值及濃度。

③逆轉錄 取約2 μg RNA作為模板進行后續的逆轉錄。反應完畢所得cDNA，置于－20℃保存。

④熒光實時定量PCR檢測 取正常對照組的cDNA進行10倍梯度稀釋后，得到標準品濃度梯度(1∶10、1∶100、1∶1 000)。反應體系 20 μL 中包括:模板 cDNA 1 μL，上、下游引物各 0.4 μL，蒸餾水 8.2 μL，SYBR Green I 10 μL。設置反應程序如下:95℃預變性10 s，95℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，重復 40 個循環。在72℃10 s收集熒光信號，循環結束后執行熔解曲線程序。各梯度濃度的相對標準品均設3個平行管，反應完畢熒光定量分析軟件自動繪制擴增曲線以及熔解曲線，通過熔解曲線分析產物的特異性。然后計算各組基因表達的相對變化。

2.6 海馬caspase－3免疫組織化學染色

①組織取材 水迷宮測試結束后，將余下小鼠經腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(80 mg/kg)，待其昏迷后打開胸腔暴露心臟，用醫用10 mL注射器，從左心室插注射針，于心尖偏上處較好，深約1 cm，待心臟略脹時用大頭針挑破右心耳;先后將生理鹽水10－20 mL，4%多聚甲醛10－20 mL緩慢注入，至肝臟發白即可停止。注畢取出大腦，放入4%多聚甲醛溶液后固定備用。

②組織處理 取各組小鼠腦組織，置于真空組織脫水儀中梯度乙醇脫水以及二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟切片機冠狀連續切片，切片厚度6 μm。切片放入60℃烤箱烤12 h。

③海馬組織caspase－3免疫組化染色 切片常規脫蠟入水;蒸餾水新鮮配制3%H2O2，室溫封閉10 min以滅活內源酶;抗原微波熱修復;滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體;加入Ⅰ抗即caspase－3抗體(1∶100)4℃過夜;PBS沖洗，5 min×3次;滴加生物素化II抗，37℃20 min，PBS沖洗，5min×3次;滴加鏈霉素化親和素試劑，37℃20 min，PBS沖洗，5 min×3次;DAB顯色:1 mL蒸餾水加DAB顯色試劑A、B、C各1滴，根據觀察顯色程度及時終止顯色;常規脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片。陰性對照為用正常血清代替Ⅰ抗，其余步驟同上。

④細胞計數 用圖像分析系統采集圖像，進行海馬CA1、CA3和DG區caspase－3陽性細胞計數，以海馬細胞胞漿棕黃色顆粒狀著色為陽性細胞，每張切片隨機取3個視野，計數陽性細胞數，并計算陽性細胞的百分比，并以其均值代表該區陽性細胞表達百分比。

3 統計學處理

用SPSS 13.0對實驗數據進行統計學處理，數據均用均數±標準差(±s)表示。水迷宮學習成績數據采用重復測量的方差分析，其余數據均采用單因素方差分析。

結 果

1 Morris水迷宮測試結果

1.1 學習成績 由表1可見，隨著訓練天數的增加各組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短，與正常對照組比較，AD模型組小鼠在第3 d和第4 d逃避潛伏期明顯延長，差異顯著(P＜0.01)。與AD模型組相比，中劑量SYD組小鼠在第3 d和第4 d逃避潛伏期均縮短，差異顯著(P＜0.05);VE組在第3 d的逃避潛伏期明顯縮短，差異顯著(P＜0.01);低和高劑量的SYD組逃避潛伏期差異無顯著(P＞0.05)。以上結果提示AD模型組造模成功，中劑量SYD和VE可以改善AD模型組小鼠的學習障礙，而低和高劑量SYD改善效果不明顯。

表1 SYD對各組小鼠在Morris水迷宮中連續4 d的逃避潛伏期比較Table 1.Effects of SYD on escape latency in 4 consecutive days in place navigation test among all groups(s.±s.n=20)

表1 SYD對各組小鼠在Morris水迷宮中連續4 d的逃避潛伏期比較Table 1.Effects of SYD on escape latency in 4 consecutive days in place navigation test among all groups(s.±s.n=20)

▲▲P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs AD model.

Group 1 d 2 d 3 d 4 d Control 45.53 ±14.01 38.12 ±11.30 27.06 ±10.8216.24 ± 9.49 AD 46.80 ±11.70 37.80 ±10.30 36.75 ± 9.61▲▲ 25.70 ± 8.13▲▲AD+2 mg·kg－1·d－1SYD 44.19 ±11.88 37.63 ±10.56 36.56 ±12.06 20.06 ±10.31 AD+4 mg·kg－1·d－1SYD 44.06 ±11.47 35.00 ± 9.66 27.69 ± 8.82* 18.06 ± 9.15*AD+8 mg·kg－1·d－1SYD 41.06 ±10.88 37.12 ± 8.82 31.76 ±10.41 22.06 ±12.92 AD+VE 41.26 ±12.30 33.58 ±13.37 26.70 ±10.99＊＊19.47 ± 9.09

1.2 記憶成績 由表2可見，與正常對照比較，AD模型組小鼠第5 d在目標象限停留時間縮短(P＜0.05)，穿越平臺次數減少，差異顯著(P＜0.01)。與AD模型組相比，低、中劑量SYD組目標象限停留時間延長，差異顯著(P ＜0.01，P ＜0.05);高劑量的SYD組目標象限停留時間和穿越平臺次數均無顯著差異(P＞0.05);VE組穿越平臺次數增多，差異顯著(P＜0.05)。以上結果提示AD模型組造模成功，低、中劑量SYD和VE在一定程度上能改善AD模型組小鼠的記憶障礙，高劑量SYD改善效果不明顯。

表2 SYD對空間探索實驗中各組小鼠在平臺象限時間和經過平臺次數的影響Table 2.Effects of SYD on staying time at platform area and frequency acrossed the platform in spatial probe test in mice(±s.n=20)

表2 SYD對空間探索實驗中各組小鼠在平臺象限時間和經過平臺次數的影響Table 2.Effects of SYD on staying time at platform area and frequency acrossed the platform in spatial probe test in mice(±s.n=20)

▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs AD model.

Group Staying time at platform area(s)Frequency acrossed the platform Control 21.43 ±10.03 4.44±1.03 AD 10.60±4.86▲ 1.75±1.33▲▲AD+2 mg·kg－1·d－1SYD 20.66±7.82＊＊ 2.07±1.10 AD+4 mg·kg－1·d－1SYD 21.20±12.29* 1.50±0.63 AD+8 mg·kg－1·d－1SYD 14.40±6.05 1.59±0.71 AD+VE 13.31±5.61 2.42±0.84*

2 海馬組織SOD活性和MDA含量的結果

與正常對照組比較，AD模型組MDA含量顯著升高(P＜0.01)，SOD活性無明顯變化(P＞0.05)。與AD模型組相比，中、高劑量SYD組SOD活性升高(P＜0.05)，MDA含量降低(P＜0.05);VE組SOD活性顯著升高(P＜0.01)，MDA含量降低(P＜0.05);低劑量SYD組效果不顯著(P＞0.05)，見表3。

表3 各組小鼠海馬組織SOD活性和MDA含量的比較Table 3.Comparison of the SOD activity and the MDA content in hippocampus of mice among all groups(±s.n=10)

表3 各組小鼠海馬組織SOD活性和MDA含量的比較Table 3.Comparison of the SOD activity and the MDA content in hippocampus of mice among all groups(±s.n=10)

▲▲P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs AD model.

Group SOD activity(103U/g protein)Contents of MDA(μmol/g protein)Control 86.22 ±11.24 1.84±0.18 AD 66.50 ±17.79 3.11±0.78▲▲AD+2 mg·kg－1·d－1SYD 85.28±23.65 2.25±0.74 AD+4 mg·kg－1·d－1SYD 94.90±23.00* 1.82±0.50*AD+8 mg·kg－1·d－1SYD 88.19±22.79* 1.93±0.44*AD+VE 99.34 ±17.33＊＊ 1.90±0.42*

3 海馬bax和bcl－2 mRNA表達的結果

3.1 熒光實時定量PCR方法觀察SYD對AD模型小鼠海馬bax mRNA表達的影響 將AD模型組小鼠海馬bax mRNA表達設為100%，其它各組與之相比:正常對照組、中劑量 SYD組和 VE組海馬 bax mRNA均表達降低，表達量分別為 AD模型組的(31.0±2.8)%、(69.0±6.4)%和(62.2±4.7)%，差異顯著(P＜0.01);高劑量SYD組與AD模型組相比，海馬bax mRNA表達也降低，表達量為AD模型組的(81.2 ±5.9)%，差異顯著(P ＜0.05)，見圖 1。

Figure 1.Effects of SYD on the expression of bax mRNA in hippocampus among all groups.±s.n=5.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs AD.圖1SYD對各組小鼠海馬腦組織中bax mRNA表達的影響

3.2 熒光實時定量PCR方法觀察SYD對AD模型小鼠海馬bcl－2 mRNA表達的影響 將正常對照組小鼠海馬bcl－2 mRNA表達設為100%，AD模型組與之相比，bcl－2 mRNA表達降低，表達量為正常對照組的(67.8 ±5.9)%，差異顯著(P ＜0.01);其余各組與AD模型組相比差異無顯著(P＞0.05)，見圖2。

Figure 2.Effects of SYD on the expression of bcl－2 mRNA in hippocampus among all groups.±s.n=5.▲▲P＜0.01 vs control.圖2 SYD對各組小鼠海馬腦組織中bcl－2 mRNA表達的影響

4 海馬組織caspase－3表達的免疫組化結果

與正常對照組相比，AD模型組小鼠海馬各區caspase－3陽性細胞的百分比均顯著增高(P＜0.01);與AD模型組相比，高劑量SYD組海馬DG區和VE組CA1區caspase－3陽性細胞的百分比減少，差異顯著(P＜0.05)，中劑量 SYD組和 VE組海馬DG區caspase－3陽性細胞的百分比顯著減少(P ＜0.01)，見表4、圖3(以海馬 DG 區為例)。

表4 各組小鼠海馬各區caspase－3陽性細胞的百分比Table 4.Percentages of caspase－3 positive cells on hippocampus CA1，CA3 and DG regions(±s.n=5)

表4 各組小鼠海馬各區caspase－3陽性細胞的百分比Table 4.Percentages of caspase－3 positive cells on hippocampus CA1，CA3 and DG regions(±s.n=5)

▲▲P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs AD model.

Control 6.00±2.20 7.39±2.09 7.74±1.90 AD 31.88±8.25▲▲ 21.22±4.97▲▲ 42.43±7.41▲▲AD+2 mg·kg－1·d－1SYD 30.47±7.31 19.86±4.45 36.99±5.80 AD+4 mg·kg－1·d－1SYD 24.19±6.75 17.57±6.76 25.30±6.24＊＊AD+8 mg·kg－1·d－1SYD 29.33±5.85 22.52±4.30 33.78±7.44*AD+VE 22.60±8.67* 16.40±2.99 21.70±5.09＊＊

Figure 3.The protein expression of caspase－3 on hippocampus DG region among all groups(×400).Red arrows indicate the caspase－3 positive cells.A:control;B:AD;C:AD+2 mg·kg－1·d－1SYD;D:AD+4 mg·kg－1·d－1SYD;E:AD+8 mg·kg－1·d－1SYD;F:AD+VE.圖3 各組小鼠海馬DG區caspase－3蛋白的表達

討 論

AD的發病機制存在多種學說，主要有β淀粉樣蛋白學說、Tau蛋白學說、遺傳因素學說、慢性炎癥學說、氧自由基導致的神經退行性病變學說等，涉及多個致病因素，如遺傳、興奮性毒性、神經營養因子缺乏、自身免疫缺陷和氧化應激等，有研究表明氧化應激在AD的病理生理過程中起著關鍵的作用［5］，是AD病理學改變的最早發生的事件之一［6］。

隨著年齡的老化或疾病的發生，腦組織內自由基生成增多或機體抗氧化體系防御功能下降，使自由基產生與清除之間失去平衡，從而誘發一系列自由基連鎖反應，破壞細胞膜、細胞內微環境、能量代謝等，導致神經元損傷、死亡，甚至引發AD［7］。本實驗用腹腔注射D－半乳糖，同時灌胃三氯化鋁來制備AD模型小鼠，結果顯示，AD模型組小鼠學習記憶能力明顯下降，海馬MDA含量明顯升高。各劑量SYD對AD模型小鼠學習記憶都有一定程度的改善，其中中劑量SYD和VE的改善作用更明顯，提高了海馬SOD酶的活性，降低了MDA的含量，表明SYD和VE能提高機體抗氧化能力，對脂質過氧化反應有明顯的抑制作用，可以保護海馬免受自由基的損傷。

機體自由基的過量產生引起的氧化應激反應可導致細胞凋亡增加。細胞凋亡是不同于細胞壞死的另一種細胞死亡形式，其過程受一系列相關基因的調控。其中Bcl－2家族在凋亡調控基因中處于重要的地位，Bcl－2蛋白是一種膜結合蛋白，存在于細胞的線粒體、核膜等處，主要生理功能是抑制細胞凋亡、延長細胞壽命;Bax蛋白是Bcl－2的同源蛋白，具有促進細胞凋亡的作用，并抑制 Bcl－2的效應［8］。本實驗結果顯示，AD模型組小鼠海馬 bax mRNA表達明顯升高，而bcl－2 mRNA表達明顯降低，高劑量SYD能夠抑制bax mRNA表達，中劑量SYD和VE效果更明顯，但各劑量SYD均未對bcl－2 mRNA表達造成明顯影響，表明中、高劑量SYD和VE可能通過減少小鼠海馬bax mRNA表達而抑制神經元的凋亡。

Caspase家族是細胞凋亡的促進因子，其中caspase－3是caspase級聯反應下游最重要的凋亡蛋白酶［9］。研究發現在一些神經元退行性變的細胞和動物模型中，有caspase－3的激活，而抑制其激活可以減少神經元的凋亡［10，11］。有研究證實抑凋亡蛋白Bcl－2和Bcl－XL通過阻止caspase－3的激活進而抑制細胞的凋亡［12］，促凋亡蛋白Bax可以使細胞色素C穿過線粒體膜，激活caspase－3而導致細胞凋亡［13］。故測定小鼠海馬神經元caspase－3蛋白的表達可以間接反映神經元的凋亡情況。本實驗結果顯示，AD模型小鼠海馬各區神經元caspase－3陽性細胞百分比增高，高劑量SYD，尤其是中劑量SYD和VE明顯抑制了caspase－3蛋白的表達，表明中、高劑量SYD和VE可能通過抑制小鼠海馬神經元caspase－3蛋白的表達而減少神經元的凋亡。

綜上所述，AD模型組小鼠學習記憶能力的下降可能與海馬的自由基生成過多造成的氧化應激損傷、bax/bcl－2 mRNA比值的增高、caspase－3蛋白表達增加等相關。自擬中藥復方SYD對AD模型組小鼠學習記憶能力的改善可能與抑制海馬神經元的凋亡密切相關，其機制可能與SYD能提高海馬神經元的抗氧化能力，減輕氧化應激損傷，降低bax mRNA的表達和caspase－3蛋白表達有關，但這些方面之間的具體關聯還有待進一步探討。

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