缺血后適應對腦缺血樹鼩海馬TLR4表達的影響*

馮 蕊， 李樹清

(昆明醫學院 1第一附屬醫院風濕免疫科，2病理生理學教研室，云南昆明650031)

腦缺血所導致的炎癥瀑布反應在腦損傷中具有重要作用，其機制迄今尚不明了。已知固有免疫(innate immunity)可影響腦缺血后炎癥反應，表現為快速而相對直接的炎癥反應，可與修飾后的內源性抗原分子相互作用［1］。Toll樣受體(Toll－like receptor，TLR)則是固有免疫的核心作用因子［2］。國外最新研究［1，3］認為 TLR與缺血耐受/免疫耐受密切相關，阻斷TLR及炎癥細胞因子信號途徑有助于腦和其它器官的缺血耐受。免疫耐受的可能機制是影響了TLR/細胞因子途徑，在刺激機體炎癥反應的同時也激發了機體抵抗炎癥反應的防御機制。最近有關TLR在腦缺血中生物學作用的研究備受關注，但與后適應的相關研究尚未見報道。

本研究以光化學法誘導樹鼩血栓性腦缺血模型，觀察血栓性腦缺血時海馬的病理組織學改變，并定量檢測缺血后適應對腦缺血不同時間海馬TLR4蛋白及mRNA表達的動態改變，探討后適應的腦保護作用是否與調控TLR4表達有關，為臨床缺血性腦疾病的防治開辟出一條新的保護途徑，具有重要的實踐意義。

材料和方法

1 動物

健康成年樹鼩126只，雌雄不限，體重(120±20)g，昆明醫學院動物實驗中心提供。整個實驗過程均由昆明醫學院實驗動物倫理委員會批準、監督與檢查。避光、清潔、安靜環境飼養，隨機分為假手術組(sham)、缺血4 h 組(ischemia 4 h，I 4 h)、缺血24 h組(ischemia 24 h，I 24 h)，缺血 72 h組(I 72 h)、缺血后適應4 h組(IP 4 h)和缺血后適應24 h組(IP 24 h)和缺血后適應72 h組(IP 72 h)，共計7個組，每組6只。實驗動物術前及術后自由進食進水。

2 樹鼩血栓性腦缺血模型的建立

按照李樹清等［4］的方法，使用腦血栓形成裝置建立樹鼩局灶性腦缺血模型。以1%硫噴妥鈉(5 mg·kg－1)腹腔注射麻醉動物，矢狀切開頭皮1 cm，細心分離部分顳肌以暴露頂區顱骨，用一塊含直徑0.5 cm窗孔的鋁片屏蔽照射區，鋁片周圍使用遮光紙遮蓋保護。實驗組動物經舌下靜脈一次性注射孟加拉紅生理鹽水(1.33 mL·kg－1)，循環10 min后，將動物置于SQ－Ⅲ型光化學誘導腦血栓形成裝置下，使光束透過鋁片窗孔直接照射于顱骨表面，在光強度1W.cm2下照射15 min，照射期間維持顱骨表面溫度于(36±1)℃。術后取出鋁片，消毒并逐層縫合切口，放入飼養籠，被蓋以保持體溫。假手術組按規定劑量注射孟加拉紅而不予光照處理。各組動物術后待清醒后自由進水、進食。實驗后4 h、24 h及72 h分別取材、觀察。

3 缺血后適應模型的建立

按照李樹清等［4］的方法，于光化學法血栓性腦缺血模型復制成功后，在缺血4 h時點前40 min，用1%硫噴妥鈉(2.5 mg·kg－1)重新麻醉動物，分離缺血側頸總動脈，在缺血4 h時點前30 min以無創動脈夾在甲狀軟骨上緣平面夾閉頸總動脈，5 min后去除動脈夾再灌注5min，如此夾閉－打開共計重復3個循環，共用時30 min。術后縫合動物頸部創口，保暖回籠，待清醒后自由進水、進食。實驗后4 h、24 h及72 h分別取材、觀察。

4 腦組織灌注與內固定

腦缺血后不同時點(4 h、24 h、72 h)或后適應后不同時點(4 h、24 h、72 h)再次麻醉動物，固定動物于手術臺板上，用眼科剪剪開腹腔，打開胸腔，剪開心包結扎降主動脈，自心尖部插入一聚乙烯管，使其進入升主動脈，扎閉主動脈根部以防回流，剪開右心耳，灌注預冷的生理鹽水100 mL，待肝臟變白后，再換為在120 mmHg壓力下緩慢滴注固定液10%甲醛200 mL行內固定2 h。固定完畢打開顱骨，取腦，再浸泡于10%甲醛中后固定24 h，腦組織與固定液之比為1∶20。常規脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋制作蠟塊標本，保存于4℃冰箱備用。行HE染色作光鏡檢查。

5 Western blotting定量檢測TLR4蛋白的表達

BCA法總蛋白質含量測定。95℃裂解3－5 min，使蛋白質變性。SDS－PAGE垂直電泳120 V、90 min分離蛋白質，并轉膜100 mA、150 min，5%脫脂牛奶37℃封閉30 min。TLR4抗兔多克隆抗體(1∶600，sc－30002，Santa Cruz)或 β －actin抗鼠單克隆抗體(1∶5 000，Abcam)4 ℃孵育過夜，0.1%TBST(Tris－buffered saline－Tween－20)洗 3次，每次15 min，辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗(1∶5 000，KPL，Gaithersburg)37 ℃孵育1 h，0.1%TBST 洗3次，每次15 min。化學發光反應試劑盒(KPL，Gaithersburg)進行反應，顯示目的蛋白質，暗室曝光。掃描X光片，用Pharmacia ImageMaster VDS軟件分析目標帶的吸光度值。

6 逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT－PCR)定量檢測TLR4 mRNA的表達

采用Bio－Tek離心柱型高純總RNA快速提取試劑盒進行組織總RNA的提取。紫外分光光度儀測定RNA樣品純度和含量。逆轉錄反應體系總體積 40 μL:含總 RNA 7.8 μg、Oligo(dT)18primer 2 μL加 DEPC 水至 24 μL、5 × reaction buffer 8 μL、Ribo-LockTMRNase inhibitor(2 ×107U/L)2 μL、10 mmol/L dNTP Mix 4 μL、RevertAid M － MuLV 逆轉錄酶(2×108U/L)2 μL，42 ℃孵育60 min，70 ℃終止反應5 min，cDNA產物－20℃保存備用。PCR擴增，以cDNA為模板，在PCR擴增儀上進行，PCR總反應體積 50 μL:RT 產物(cDNA)2 μL、下游引物 1 μL、上游引物 1 μL、2 ×Power Tag PCR MasterMix 25 μL，加ddH2O補足至50 μL。按下述反應條件進行聚合酶鏈反應:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃45 s，35個循環;72℃ 7 min。目的基因TLR4及內對照β－actin引物序列見表1。取10 μL PCR擴增產物加樣，以500 bp的DNA marker作標記于2%瓊脂糖中電泳90 min(電壓100 V)，溴乙啶染色，紫外分析儀下檢測擴增產物，照片后用Pharmacia ImageMaster VDS軟件分析目標帶的吸光度值。

表1 RT－PCR引物序列Table 1.Sequences of primers for RT－PCR

7 統計學處理

結 果

1 后適應對腦缺血海馬神經元形態學改變的影響

隨缺血時間的延長，海馬損傷進行性加重，后適應后各時點損傷均明顯減輕。假手術組海馬結構完整，層次清晰，海馬神經元形態結構未見異常，CA1區椎體細胞形態正常，細胞核大而園，核仁明顯，見圖1。缺血4 h時海馬可見數個神經元嗜酸性變，后適應4 h組可見神經元嗜酸性變減少;缺血24 h時可見大量神經元嗜酸性變、核固縮，結構紊亂，見圖2，后適應24 h組海馬神經元損害明顯減輕，見圖3;缺血72 h時可見神經元減少，細胞層次減少，后適應72 h組神經元嗜酸性變減少，細胞層次增加。

Figure 1.Histological structure of hippocampus in tree shrews from sham －operation group(HE staining，×400).圖1 假手術組海馬組織結構

Figure 2.Histological changes of hippocampus 24 h after cerebral ischemia in tree shrews in I24h group(HE staining，×400).圖2 缺血24 h海馬組織學改變

Figure 3.Histological changes of hippocampus 24 h after cerebral ischemia in tree shrews in IP24h group(HE staining，×400).圖3 缺血后適應24 h海馬組織學改變

2 樹鼩血栓性腦缺血及缺血后適應不同時點海馬TLR4蛋白的表達

血栓性腦缺血后4 h和24 h海馬TLR4蛋白表達較對照組明顯增強(P＜0.05)，72 h與假手術組相比表達減弱(P＜0.05)。隨缺血時間的延長(4 h、24 h、72 h)，缺血組TLR4的表達呈逐漸減少趨勢，72 h時最低。后適應處理組與假手術組對比，4 h TLR4表達有所增多，但無顯著差異(P＞0.05)，24 h TLR4表達顯著減少(P＜0.05)，72 h TLR4表達增多(P＜0.05)。后適應組與缺血組對比，經后適應處理后4 h和24 h海馬TLR4表達顯著減少(P＜0.05)，但72 h海馬TLR4表達增加(P＜0.05)，見圖4、5。

Figure 4.Representative Western blotting image of TLR4 in ischemic hippocampus of tree shrews at different time points.Sham:sham － operation group;I4 h，I24 h and I72 h:ischemia 4 h，24 h and 72 h groups，respectively;IP4 h，IP24 h and IP72 h:ischemic postconditioning 4 h，24 h and 72 h groups，respectively.圖4 樹鼩血栓性腦缺血及缺血后適應不同時點海馬TLR4免疫印跡

Figure 5.The TLR4 protein expression in hippocampus of tree shrews at different time points after cerebral ischemia.±s.n=6.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs the cerebral ischemia group.圖5 樹鼩血栓性腦缺血及缺血后適應不同時點海馬TLR4蛋白表達

3 缺血后適應對腦缺血不同時點海馬TLR4 mRNA表達的影響

結果顯示:與對照組相比，血栓性腦缺血后4 h、24 h及72 h海馬TLR4 mRNA表達明顯增強(P＜0.05)。隨缺血時間的延長(4 h、24 h、72 h)，缺血組TLR4 mRNA表達進行性降低(4 h、24 h)，72 h最低。后適應處理組與正常組對比，4 h TLR4 mRNA表達顯著降低(P＜0.05)，24 h和72 h TLR4 mRNA 表達增加(P＜0.05)。后適應組與缺血組對比，經后適應處理后在4 h和24 h時點，TLR4 mRNA表達較腦缺血組明顯減少(P＜0.05)，然而72 h時點TLR4 mRNA表達較腦缺血組明顯增多(P＜0.05)。后適應組TLR4 mRNA表達總的趨勢是逐漸遞增的，見圖6、7。RT－PCR分析顯示海馬TLR4 mRNA的表達規律與Western blotting分析所示海馬TLR4蛋白的表達規律基本一致。

Figure 6.RT－PCR analysis of mRNA expression of TLR4 and β－actin in hippocampus of tree shrews after cerebral ischemia and ischemic postconditioning.Lane 1，2:sham － operation group;Lane 3，4:ischemia 4 h group;Lane 5，6:ischemic postconditioning 4 h group;Lane 7，8:ischemia 24 h group;Lane 9:marker of DL500;Lane 10，11:ischemic postconditioning 24 h group;Lane 12，13:ischemia 72 h group;Lane 14，15:ischemic postconditioning 72 h group.圖6 樹鼩血栓性腦缺血及缺血后適應不同時點海馬TLR4 mRNA表達

Figure 7.The TLR4 mRNA expression in ischemic hippocampus of tree shrews at different time points after cerebral ischemia.±s.n=6.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs the cerebral ischemia group.圖7 樹鼩血栓性腦缺血及缺血后適應不同時點海馬TLR4mRNA表達

討 論

上世紀80年代有學者發現果蠅背腹部體軸分化發育所必需的一種跨膜蛋白，稱之為Toll樣受體。1997年，首次證實人Toll樣受體與果蠅同源。TLR廣泛分布于中樞神經系統，在應對感染、缺血、創傷等損傷方面發揮重要作用，而TLR則是固有免疫的核心作用因子［2］。TLR4是Toll樣受體家族研究頗多且極具代表性的一個。神經元已被證實可表達TLR4［5］。受損組織和壞死細胞以及血管和細胞間質損傷后可釋放TLR4的內源性激活物，由TLR4觸發級聯免疫炎癥反應，TLR4極可能是腦內免疫炎癥反應鏈條上的上游核心作用因子［6］。缺血后適應的發現提示，機體缺血狀態下，內部天然內源性保護機制的激活對機體抗損傷反應具有特殊的生物學意義。缺血后適應可能有賴于TLR及其信號轉導通路的調節變化來抑制缺血所致免疫炎癥反應。缺血后適應可調節機體異常的免疫炎癥反應，激活機體內源性調節保護機制，避免更嚴重的細胞損傷［7］。新近研究發現后適應可產生某種抗炎癥反應效應［8］。

本研究發現血栓性腦缺血組海馬TLR4表達明顯增加，提示腦缺血時TLR4作為炎性損傷因子與缺血后腦損傷相關，與既往報道［9］一致。腦缺血后4 h及24 h海馬TLR4蛋白和 mRNA的表達增強，可能與嚴重腦缺血所致細胞應激，蛋白合成加速有關。研究發現TLR4是神經元死亡的主要原因，TLR4活化小膠質細胞及TLR4信號啟動炎癥毒性反應與此有關［10］。隨缺血時間的延長，缺血組TLR4的表達呈逐漸減少趨勢，缺血72 h時TLR4蛋白和 mRNA的表達恢復至對照水平，與我室既往觀察其它指標的變化趨勢一致，可能與腦缺血后期腦組織的抗損傷反應有關，對受損細胞的修復可能具有積極意義。后適應處理后4 h和24 h TLR4蛋白表達減少，而后適應72 h TLR4蛋白表達增加。海馬TLR4 mRNA的表達趨勢與蛋白表達基本一致。同時伴隨的是后適應各時點海馬神經元損傷明顯減輕。后適應產生的神經元保護作用與我室的前期研究相吻合。我們的前期研究發現缺血后適應有較好的腦保護作用，表現為增加局部腦血流［4］，縮小皮層梗塞面積以及抑制海馬CA1區神經元的凋亡(另文)。后適應可使4、24 h時點TLR4蛋白及mRNA表達減弱，提示TLR4在腦缺血中的作用可能具有損傷效應。

然而后適應致72h TLR4蛋白及mRNA表達顯著增強的機制值得進一步探索。同時，我們也觀察到在后適應各時點TLR4蛋白及mRNA表達是呈逐漸增高的趨勢，這也提示TLR4在腦缺血后適應中的作用是一個動態連續的過程。TLR4可促進腦組織再生修復［11］。Marsh等［12］研究認為預適應可“再編輯”TLR信號通路，最終達到某種炎癥因子和抗炎因子之間的平衡，起到腦保護作用，這種內源性的調控機制是機體有效的自我保護措施。我們推測后適應是否亦有類似作用，后適應的腦保護作用在腦缺血損傷急性期(＜72 h)可能與抑制TLR4的表達有關，但在腦缺血損傷中后期(≥72 h)可能與TLR4表達增加有關。Buchanan等［13］亦認為TLR4既可以起保護作用又可以是損傷性因子，這取決于不同的神經生理條件。海馬TLR4蛋白和mRNA的表達均在缺血4 h達高峰，其TLR4的動態變化在時間進程上較皮層的24 h要早(待發表)，顯然與海馬特殊的結構與功能有關。

綜上所述，TLR4可能在缺血后適應介導的腦保護機制中發揮作用，今后尚有待更多更全面深入的研究予以證實，同時早日將缺血后適應運用到臨床缺血性腦卒中的防治中去。

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