硫糖鋁在體外對抗幽門螺桿菌HpaA IgY的保護作用評價

鄧西川 黃 偉 戴 維 胡曉莉 沈旭東 楊致邦*

（1 重慶醫科大學基礎醫學實驗教學中心病原生物學與免疫學實驗室，重慶 400016；2 西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 402460；3 重慶醫科大學臨床醫學五年制2007級4班，重慶 400016）

大量研究已經表明，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）是人類常見的感染病原之一，是多種胃疾病的生物致病因素，也是發生胃癌的重要危險因素，世界衛生組織已將其列為第一類生物致癌因子[1]，防治HP感染具有重要的臨床意義。

近年來，許多研究已經證實口服卵黃免疫球蛋白（immunoglobulin yolk，IgY）可通過被動免疫有效防治胃腸道感染性疾病[2,3]，但在胃內，由于受到高酸性和高胃蛋白酶的生態環境的影響，使其應用受到限制。提高IgY對酸和蛋白酶的耐受性對口服IgY的開發具有重要意義。硫糖鋁（sucralfate）作為抗消化性潰瘍的制劑已在臨床廣泛應用。該藥對胃黏膜具有黏附性，可與許多大分子物質如黏液、糖脂蛋白等結合；并可與胃黏膜表面的黏液結合形成復合的膠狀物，起到黏膜保護作用[4]。

HP在胃內定植的關鍵環節是黏附，其黏附素（Helicobacter pylori adhesin A，HpaA）具有黏膜結合特性，由黏附素受體系統介導與宿主細胞發生特異性黏附，從而使HP定植于胃內[5]。本文制備抗HP的重組HpaA特異性IgY，將適當比例的硫糖鋁加入HpaA IgY中，以提高HpaAIgY對酸和蛋白酶的耐受性，通過體外試驗評價硫糖鋁對HpaA IgY的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

H.pylori重組菌DH5α-hpaA-pQE30為本實驗室構建[6]并保存，Ni2+-NTA親合層析柱為Qiagen公司產品；30周齡立克體雞由西南農業大學榮昌分校生物中心提供，常規飼養；HRP標記的羊抗雞IgG、羊抗人IgG購自Southern Biotech公司；檢測血中抗HP特異性IgG的Western blot試劑盒購自上海元谷科技發展公司；HP選擇培養基、LA培養基、ELISA試驗中的抗原包被液、酶稀釋液、顯色劑等為本室配制；HpaA（+）血清為本實驗室從HP陽性的患者血清篩選；胃蛋白酶購自Amresco公司產品；硫糖鋁混懸液購自上海旭東海普制藥公司。

1.2 方法

1.2.1 制備重組HpaA抗原

將表達菌DH5α-hpaA-pQE30接種于LA培養基中，37℃振搖培養16h。再轉種于LA培養基中，37℃培養至細菌濃度達到A600＝0.6時，用1mmol/L的IPTG誘導表達4h；再將菌液4℃、8500r/min離心10min；收集沉淀物超聲碎菌，4℃、8500r/min離心45min；加入包涵體裂解液裂解2h，4℃、8500r/min離心45min，取上清液，用Ni2+-NTA樹脂親和層析純化。純化物用12%SDS-PAGE分析，用Bradford法測定純化物的蛋白含量；用Western blot鑒定重組蛋白的抗原性；將重組蛋白免疫家兔，用間接ELISA法檢測其血清的抗hpaA效價以鑒定其免疫原性；-70℃保存備用。

1.2.2 制備抗重組HpaA的IgY

以純化的重組hpaA為抗原，參照黃進等[7]的方法，將重組hpaA與等量完全弗氏佐劑充分研磨乳化后接種洛曼母雞[6]。初次接種劑量為100μg/只；15d后進行第2次接種，200μg/只；以后每隔1個月進行一次加強免疫，計量為300μg/只，共接種2次。在末次接種后1周開始收集雞蛋，取出蛋黃液混合后，先用水稀釋，再用氯仿粗提hpaAIgY，飽和硫酸銨法純化，最后過濾除菌。純化蛋白用12%SDS-PAGE分析，Bradford法測定IgY蛋白含量，間接ELISA法測定hpaAIgY效價，-20℃保存。

1.2.3 強酸下硫糖鋁對HpaAIgY的保護作用觀察

參照Kyong AL[8]的方法，用pH值分別為1.5、2.0、3.0的磷酸二氫鈉緩沖液將hpaA IgY稀釋后，分別加入10%～60%的硫糖鋁（體積百分比），使IgY終濃度為1mg/mL；37℃維持2h后，立即加入適量的NaOH（2mol/L）中和，將pH值調至7.0，ELISA法測定IgY的A450值。將含1mg/mL pH7.0的IgY稀釋液37℃維持2h作為參照，以IgY試驗液的A450值與參照IgY的A450值之比測算IgY的剩余抗體活性，用（AR/AC）%表示。與同樣條件處理但未加硫糖鋁的IgY液為對照，評價硫糖鋁對hpaA IgY的保護作用。

1.2.3.1 硫糖鋁對胃蛋白酶裂解HpaAIgY的保護作用觀察

參照Kyong AL[8]的方法，用pH 2.0、pH 3.0的磷酸二氫鈉緩沖液將hpaA IgY稀釋后，分別加入終濃度為0.02mg/mL的胃蛋白酶，再分別加入10%、30%、50%的硫糖鋁，使IgY終濃度為1mg/mL；37℃維持4h，立即加入適量的NaOH（2mol/L），將pH值調至7.0，ELISA法測定IgY的A450值。以同樣條件處理的未加胃蛋白酶和硫糖鋁，pH7.0含1mg/mL的hpaA IgY稀釋液作參照，并按前述方法計算其剩余抗體活性。以同樣條件處理加胃蛋白酶未加硫糖鋁的IgY液為對照，評價硫糖鋁對胃蛋白酶裂解hpaA IgY的保護作用。

1.2.3.2 反復凍融下硫糖鋁對特異性IgY的保護作用

用pH7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋hpaA IgY，再分別加入10%、30%、50%的硫糖鋁，使IgY的終濃度為1mg/mL，4℃反復凍融7次，每次間隔1h；以未凍融處理、未加硫糖鋁、在4℃存放的同樣稀釋度的IgY為參照，ELISA法檢測IgY的A450值，并按前述方法計算其剩余抗體活性。以同法處理的不加硫糖鋁的IgY液為對照，評價在反復凍融條件下硫糖鋁對hpaA IgY的保護作用。

2 結 果

2.1 重組hpaA抗原的制備

表達的重組hpaA蛋白經SDS-PAGE后凝膠掃描圖象軟件分析，破碎菌的上清與沉淀在相對分子質量30000處均可見明顯的外源蛋白的表達帶，約占全菌的70%。經純化后可見單一條帶，純度達90%以上，見圖1。Bradford法測定重組蛋白含量為1.08mg/mL。Western blot鑒定在相對分子質量30000處出現相應的條帶，大小與預期的一致（圖2）。ELISA法測得免疫后兔抗血清與VacA抗原反應的效價為1∶1280。

圖1 重組HpaA蛋白表達的SDS-PAGE分析

圖2 重組HpaA蛋白的Western blot分析

2.2 抗重組hpaA特異性IgY的制備

蛋黃液純化濃縮后，測得其hpaA IgY的蛋白含量為6.4mg/mL；經SDS-PAGE分析，在相對分子質量65000和25000處分別可見兩條條帶，與IgY重鏈和輕鏈的分子質量相符（圖3），IgY的兩重鏈及兩輕鏈之和與總相對分子質量180×103相符合。凝膠掃描圖象軟件分析其純度為72.0%。ELISA法測得I其效價為1∶12800。

2.3 各種保護作用的觀察

2.3.1 強酸下硫糖鋁對特異性IgY的保護作用

在強酸條件下，加入硫糖鋁后抗體活性明顯提高，并隨硫糖鋁濃度增高而提高。在pH 1.5條件下，未含硫糖鋁的hpaA IgY的抗體活性僅能維持30.5.%；含30%硫糖鋁的IgY的剩余抗體活性為35.4%，含50%硫糖鋁的IgY可使剩余抗體活性提高到48.2%，含60%硫糖鋁的IgY可使剩余抗體活性提高到65.8%。在pH 2.0條件下，未加硫糖鋁之IgY剩余抗體活性為35.6%，含30%硫糖鋁的IgY可使剩余抗體活性提高到85.4%，含50%的硫糖鋁的IgY幾乎可完全保持其抗體活性。在pH 3.0條件下，不加硫糖鋁的IgY抗體活性能保持64.8%，30%硫糖鋁即可使IgY抗體活性保持87.3%，而50%以上濃度的硫糖鋁幾乎可完全保持IgY的抗體活性（圖4）。

2.3.2 硫糖鋁對胃蛋白酶裂解特異性IgY的保護作用

在pH 2.0 、3.0和0.02mg/mL胃蛋白酶濃度條件下，加硫糖鋁的hpaA IgY抗體的剩余活性隨硫糖鋁的濃度增高而提高。在pH 2.0 時，不加硫糖鋁的IgY抗體的剩余活性為20.1%，含10%、30%、50%硫糖鋁IgY的剩余活性分別為62.8%、71.6%、82.5%。在pH 3.0 時，不加硫糖鋁的IgY抗體的剩余活性為42.4%，含10%、30%、50%硫糖鋁IgY的剩余活性分別為75.6、87.4%、94.5%（圖5）。與不加硫糖鋁比較，差異有顯著性（P＜0.01）。

圖3 純化后IgY的SDS-PAGE分析

圖4 在pH 1.5、2.0和3.0條件下加入0%～60%硫糖鋁hpaA IgY的剩余抗體活性

2.3.3 反復凍融下硫糖鋁對特異性IgY的保護作用

經反復凍融后，未含硫糖鋁的IgY的剩余抗體活性下降至62.4%，加入硫糖鋁后，隨所含硫糖鋁濃度的增高，其剩余抗體活性也提高。含10%硫糖鋁的IgY可使其剩余抗體活性提高到70.6%，含30%硫糖鋁的IgY可使其剩余抗體活性提高到82.7%，50%硫糖鋁可提高到89.3%（圖6）。

圖5 在pH 2.0、3.0和0.02mg/mL的胃蛋白酶條件下加入10%、30%和50%硫糖鋁的hpaA IgY的剩余抗體活性

圖6 反復凍融下硫糖鋁對HpaA IgY的保護作用

3 討 論

高酸性和含高濃度的胃蛋白酶是胃內生態環境最主要的特點。陳劍秋等[9]對健康成人胃內24h pH值的動態檢測表明，胃內pH值的基線為（1.63±0.34），當進食時pH值升高，胃內食物排空后降至基線水平。正常成人胃內的胃蛋白酶濃度為0.02 mg/mL，胃蛋白酶作用的最適pH為1.5～2.2，最適溫度為37 ℃左右。因此，防治HP感染的制劑在胃內必須耐受高酸性和高蛋白酶的作用才能奏效。

Kyong等[10]的報道表明，當pH＜3時，IgY的抗體活性可降低50%，在pH 2.0條件下4h，IgY幾乎完全失活。在pH3.0條件下，加入30%山梨醇可顯著提高IgY的穩定性，加入50%山梨醇可完全維持IgY的抗體活性。Xiao等[11]用殼聚糖-藻酸鹽微膠囊包裹IgY，將膠囊置于pH3.0～6.0的模擬胃液中試驗，其結果可使IgY活性維持到61.36%～74.61%。本文的結果表明，在IgY液中加入硫糖鋁，可顯著提高IgY在酸性環境中的穩定性，其保護作用明顯優于糖類，也優于用殼聚糖-藻酸鹽微膠囊包裹IgY。30%～50%硫糖鋁可在胃內pH 2.0和含0.02mg/mL胃蛋白酶的模擬胃液環境中有效保護IgY的活性，提高IgY抗凍融力。

硫糖鋁是一種含8個硫酸根的蔗糖硫酸酯鋁鹽（C12H30Al8O5lS8xAl（OH）3yH20），其硫酸蔗糖部分在堿性的氫氧化鋁分子之間交聯，為立體結構的橋形復合物，黏附性強，帶負電荷，能與多種帶正電荷的化學基團或大分子物質結合，如黏液、糖脂蛋白以及藥物、金屬等；也可與胃十二指腸黏膜表面的黏液結合，形成復合的膠狀物，對黏膜起到保護作用[4,12]。硫糖鋁遇酸解離之后，其氫氧化鋁凝膠可發揮抗酸作用，不僅可緩解強酸環境，也可破壞胃蛋白酶作用的最適酸性環境。而且，硫糖鋁本身可與胃蛋白酶絡合，直接、持續地抑制胃蛋白酶的活性。用硫糖鋁作為IgY的保護劑，不僅可降低胃酸和胃蛋白酶對IgY的破壞作用，還可發揮硫糖鋁本身對胃黏膜的保護作用，是比較理想的IgY保護劑。因此，制備含硫糖鋁的hpaA特異性IgY有望使IgY在胃內發揮更加有效的預防HP感染的作用。

[1] International Agency for Research on Cancer.Schistosomes,liver flukes and Helicobacter pylori[M].IARC Monograph on the Evaluation of Carcinggenic Risks to Human.Lyon： IARC,1994.

[2] Mine Y,Kovacs-Nolan J.Chiken egg yolk antibodies as therapeutics in enteric infections disease[J].J Med Food,2002,5(3)：159-169.

[3] Suzuki H,Nomura S,Masaoka T,et al.Effect of dietary anti-Helicobacter pylori-urease immunoglobulin Y on Helicobacter pylori infection[J].Alimentary Pharmacology and Therapeutics,2004,20(9)：185-192.

[4] Ochi Kiyoshige.Chemistriy of sucralfate[M].New York：Pienum Medical book Company,1995：47-58.

[5] Jones AC,Logan RP,Foynes S,et al.A flagellar sheath protein of Helicobacter pylori is identical to HpaA,a putative N-acetylneuraminyllactose-binding hemagglutinin,but is not an adhesin for AGS cells[J].J Bacteriol 1997,179(17)：5643-5647.

[6] 吳利先,楊致邦,林珊等.幽門螺桿菌臨床株粘附素HpaA基因的克隆表達及在診斷中的價值[J].中國人獸共患病雜志,2004,20(4)：275-278.

[7] 黃進,楊致邦,黃偉等.抗幽門螺桿菌rHpaA雞蛋黃抗體的研制[J].中國免疫學雜志,2006,22(10)：937-939.

[8] Kyong AL,Sung KC,Yoon JL,et al.Acid stability of anti-Helicobacter pylori IgY in aqueous polyol solution[J].J Biochem Mol Biol,2002,35(5)：488-493.

[9] 陳劍秋,許蘭薇,張穎等.健康成人24小時pH節律的觀察[J].天津醫藥,1997,25(11)：668-670.

[10] Shimizu M,Miwa Y,Hashimoto K,et al.Encapsulation of chicken egg yolk immunoglobulin G (IgY) by liposomes[J].Biosci Biotechnol Biochem,1993,57(9)：1445-1449.

[11] Xiao YL,Li JJ,TimA MA,et al.Chitosan-Alginate Microcapsules for Oral Delivery of Egg Yolk Immunoglobulin (IgY) Agric[J].Food Chem,2007,55 (8)：2911 -2917.

[12] Ishimori A.History of the development of sucralfate[M].New York：Plenum Medical book Company,1995：35-45.