兩種凍融方法對小鼠成熟卵母細胞冷凍效果的研究

劉新雄

兩種凍融方法對小鼠成熟卵母細胞冷凍效果的研究

劉新雄

目的 探討不同冷凍方法對成熟期(MⅡ)卵母細胞體外受精及胚胎發育能力的影響。方法 收集昆明小鼠 MⅡ期卵母細胞,分別行玻璃化冷凍與程序化冷凍。解凍后比較兩組復活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。結果 玻璃化冷凍法冷凍 MⅡ期卵母細胞解凍后存活率顯著高于程序化冷凍組的(80.1%vs.55.5%,P＜0.01),并且兩組的囊胚形成率比較,差異有統計學意義(28.6%vs.19.4%,P＜0.05)。結論 在進行卵母細胞冷凍保存時,玻璃化冷凍法冷凍效果好于程序冷凍法。

小鼠;卵母細胞;玻璃化冷凍;胚胎發育

卵母細胞凍存是輔助生育領域的研究熱點之一,冷凍技術主要有程序化冷凍及玻璃化冷凍法。近年來由于冷凍技術和方法的改進,特別是玻璃化冷凍技術的發展,凍融卵母細胞的復蘇率和受精率均有所提高,然而由于卵母細胞結構的特殊性,卵母細胞冷凍保存效果尚不理想[1,2]。本研究以小鼠MⅡ期卵母細胞為模型,應用程序化冷凍法與玻璃化冷凍法分別冷凍小鼠成熟期(metaphageⅡ,MⅡ)卵母細胞,比較兩組卵母細胞解凍后的發育潛能,旨在為人卵母細胞的冷凍保存提供參考依據與理論。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗動物為購自廣西醫科大學實驗動物中心昆明小鼠 30只,體質量為 25～35 g,飼養條件為光照 14 h,黑暗 10h,小鼠可自由飲水、進食。

1.2 收集卵母細胞 小鼠適應性飼養一周后,于雌鼠腹腔內注射人絕經期尿促性腺激素(HMG)10 IU,48 h后注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10 IU,16～18h后頸椎脫臼法處死小鼠,收集有顆粒細胞的卵母細胞并將其置于 80 IU/ml的透明質酸酶中,收集并選擇形態正常、有第一極體的卵母細胞進行冷凍。

1.3 卵母細胞的冷凍與解凍 將收集的MⅡ期卵母細胞分別行程序化冷凍和玻璃化冷凍。程序化冷凍方法:冷凍和解凍均按照說明書進行操作。玻璃化冷凍方法:冷凍:先將卵子在 PBS+15%胎牛血清(FCS)溶液中沖洗 2～3次,再移入10%乙二醇(EG)+10%二甲基亞砜(DMSO)溶液中停留30s,然后移入 20%EG+20%DMSO+0.5mol/L蔗糖溶液中,用 OPS管通過虹吸作用將卵吸入管中,投入液氮。解凍:依次將卵子移入含 0.5mol/L、0.25mol/L、0.1mol/L的蔗糖溶液中,各停留 3min。再移到培養液中沖洗3～4次,然后將細胞質結構正常、透明帶完整、周圍間隙小的卵母細胞移入培養液中,放入 5%CO2培養箱中培養。

1.4 體外受精及培養 在受精當天,選用性成熟的成年雄性昆明小鼠,頸椎脫臼處死后,刺破附睪尾部,獲得的精液懸浮液置 37℃培養箱中培養 1～2h獲能后,以 5×106/ml的終濃度進行授精。6～9 h后顯微鏡下鏡檢,觀察受精情況(見第二極體或雙原核的卵判為已受精),將受精卵移入卵裂培養液培養皿中,置于二氧化碳培養箱中培養,每天觀察受精卵的發育情況并記錄。

1.5 統計學方法 采用SPSS 10.0統計軟件對數據進行處理,計數資料采用 χ2檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

解凍后,采用玻璃化冷凍法冷凍的 MⅡ期卵母細胞復活率為 80.1%,顯著高于程序冷凍法組的 55.5%(P＜0.01)。解凍后卵母細胞的囊胚形成率分別為 28.6%和 19.4%,差異有統計學意義(P＜0.05)。兩組受精率、卵裂率相比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。見表 1。

表 1 兩種冷凍方法對小鼠成熟期卵母細胞冷凍效果的影響(例,%)

3 討論

卵母細胞冷凍是輔助生育技術(assisted reproductive technology,ART)領域的研究熱點之一。1986年全世界第一例通過凍存卵母細胞獲得試管嬰兒成功降生,然而由于卵母細胞體積大、細胞膜與細胞漿比例小等自身生物學特點[3],卵母細胞冷凍發展較慢,目前臨床上尚未廣泛應用,僅局限于實驗研究。卵母細胞冷凍技術主要有程序冷凍與玻璃化冷凍。程序化冷凍法是將胚胎放置在一定濃度的冷凍保護液內,程序冷凍儀運行預設的程序緩慢降溫使細胞逐步實現脫水,當達到預設定溫度后快速投入液氮而達到冷凍保存的目的。程序化慢速冷凍法是一種有效的方法,但無法避免凍融過程中冰晶形成對胚胎的損傷。玻璃化冷凍是一種快速冷凍技術,可使細胞迅速通過“危險溫度區”,降低細胞對低溫的敏感性,使其從液態直接變為無結構的玻璃狀態,從而保持溶液狀態的分子和離子分布,避免冰晶的形成,減少了細胞的機械性損傷,使細胞得以在降溫過程中保持結構的完整。

本研究分別采用程序化冷凍法和玻璃化冷凍法保存小鼠MⅡ期卵母細胞,結果顯示,玻璃化冷凍法冷凍組的卵母細胞復活率達 80.1%,而程序化冷凍法的復活率只有 55.5%,差異有統計學意義(P＜0.01)。玻璃化冷凍法組的囊胚率達到了 28.6%,顯著高于程序冷凍法組的 19.4%(P＜0.05)。這可能是因為玻璃化技術的快速降溫,使卵母細胞快速越過冰晶形成溫區(5℃～15℃)之間,這樣避免細胞內外冰晶的形成,盡可能地減小冰晶對透明帶及細胞骨架的損傷,說明玻璃化技術比傳統程序冷凍法能更好地保護卵母細胞,與其他學者的研究結果相似[4,5]。

總之,從以上結果可看出玻璃化冷凍小鼠卵母細胞的效果明顯優于程序冷凍法,說明玻璃化冷凍法的冷凍效果比程序冷凍法好。這可能與玻璃化技術快速降溫避免了冰晶對卵母細胞的損傷等有關。因此,玻璃化技術是一種有效、簡便、安全的低溫冷凍技術。隨著低毒性的玻璃化液被發現與運用,凍融后卵母細胞的復活率、受精率、卵裂率及囊胚率的提高,玻璃化技術將成為卵母細胞凍存的主要方法。

[1] Kim TJ,Laufer LR,Hong SM,et al.Vitrification of oocytesproduces high pregnancy rates when carried out in fertilewoman.FertilSteril,2010,93:467-474.

[2] 廖宏慶,林戈,陸長富,等.不成熟卵母細胞的體外成熟培養及玻璃化冷凍.中國現代醫學雜志,2010,20(11):1614-1617.

[3] Lucena E,Bernal DP,Lucena C,et al.Successful ongoing pregnancies after vitrification of oocytes.Fertil Steril,2006,85(1):1082-1111.

[4] AntinoriM,Licata E,Dani G,et al.Cryotop vitrification ofhuman oocytes results in high survival rate and healthy deliveries.Reprod Biomed Online,2007,14(1):72-79.

[5] Liebermann J,Tucker MJ.Sills ES.Cryoloop vitrification in assisted reproduction:analysis of survival rates in 1000 human oocytes after ultra-rapid cooling with polymer augmented cryoprotectants.ClinExpObstetGynecol,2003,30(23):125-129.

Study of the effect of different methods for mature oocytes cryopreservation in rats

LIU Xin-xiong.Qinzhou Maternal and Child Health Hospital Fertility Center,Guangxi53500,China

Objective To explore the effect of differentmethodson in vitro fertilization(IVF)and embryonic developmental capacity of thawedmetaphageⅡ(MⅡ)stage oocytes.Methods The oocytes on MⅡstage were collected,then were cryopreserved by programmed cryopreservation and vitrification cryopreservation.The thawed oocyteswere cultured to observe the rates of survival,IVF,cleavage and bastocyst.Results The survival rate ofoocytesby vitrification cryopreservation was significantly higher than those by programmed cryopreservation(80.1%vs.55.5%,P＜0.01).Therewasalso significantdifference in the ratesofbastocyst in differentgroups(28.6%vs.19.4%,P＜0.05).Conclusion Vitrification cryopreservation ismore effective in oocytes cryopreservation on MⅡstage.

Mouse;Oocytes;Vitrification;Embryonic development

535000廣西欽州市婦幼保健院生殖中心