ELISA測定疫苗中慶大霉素含量的結果評價分析

劉少剛 吳潔

（汕頭大學醫學院 廣東汕頭 515041）

在現有疫苗的生產過程中常加入慶大霉素等抗生素。抗生素類藥物對感染性疾病有重大的治療作用，然而濫用抗生素會產生無法挽回的不良后果。中國和美國等國家都制定了生物制品中抗生素的最大殘留限量指標，以嚴格控制在生物制品生產中加入抗生素的量[1]。

常用的檢測疫苗中抗生素含量的方法有微生物學方法、理化方法和免疫分析方法[2]。而間接競爭ELISA試劑盒測定法具有操作時間短、特異性好、速度快、操作誤差小等特點[3]，以至于得到了廣泛的應用。本文采用酶標試劑盒間接競爭ELISA法，并將乙型腦炎減毒活疫苗進行10倍稀釋來測定乙型腦炎減毒活疫苗中慶大霉素的含量。通過以慶大霉素標準品為對照物，測定了疫苗制品中殘留抗生素的含量，以建立疫苗中抗生素含量檢測的有效方法，通過控制疫苗中抗生素的含量，來提高疫苗使用的安全性。

1 材料與樣品

1.1 試劑與儀器

慶大霉素ELISA快速檢測試劑盒(北京望爾生物技術有限公司)。硫酸慶大霉素注射液(批號09062027，天津藥業焦作有限公司)；酶標儀(Mode l550，美國BIO-RAD)；洗板機；微量加樣器；電熱恒溫水浴鍋；振蕩器；慶大霉素標準品(批號200814，含量638U/mg，中國藥品生物制品檢定所)。疫苗穩定劑由廣東省汕頭市生物制品研究所疫苗室提供。

表1 實驗數據及測定結果

表2 慶大霉素在乙型腦炎減毒活疫苗中的回收率

圖1 標準曲線圖

1.2 疫苗

乙腦減毒活疫苗和未含慶大霉素的乙腦減毒活疫苗購自廣東省汕頭市生物制品股份有限公司。

1.3 樣品

1人份規格的乙型腦炎減毒活疫苗12批，5人份規格的乙型腦炎減毒活疫苗12批，均由北京天壇生物制品股份有限公司提供；生產原材料、原液、輔料及半成品由成都生物制品研究所生產管理部提供。

2 實驗方法和結果

2.1 標準品溶液的制備

精密稱取適量慶大霉素標準品，加未含慶大霉素的乙腦減毒活疫苗10倍稀釋液[4～6]配制成使慶大霉素含量分別為0.1、0.15、0.5、1.5、5、40ng/mL，即得一系列標準品溶液。

2.2 標準曲線的繪制

采用間接競爭ELISA方法，按試劑盒說明書進行操作。參考王靜[7]等的對數直線方程法進行標準曲線的制備。以慶大霉素標準品溶液吸光度A450測定值的對數為縱坐標，以慶大霉素標準品溶液濃度的對數為橫坐標，繪制標準曲線，得標準曲線方程Y=-0.4354X-0.5431(R2=0.9974)。結果表明，慶大霉素在0.1～8ng/mL范圍內樣本吸光值與慶大霉素含量呈良好的負相關關系（表1和圖1）。

2.3 慶大霉素在乙型腦炎減毒活疫苗中的回收率

采用ELISA試劑盒的檢測方法對慶大霉素標準品溶液進行加樣回收率的檢測。精密稱取含已知慶大霉素含量的乙型腦炎減毒活疫苗10倍稀釋液的同一份樣品9份，分成3組，3組分別加入0.5、1.0、5ng/mL的標準慶大霉素溶液各1.0mL，得低中高3種濃度的樣品溶液。按ELISA試劑盒的檢測方法測定樣品溶液。計算慶大霉素在乙型腦炎減毒活疫苗中的平均回收率為96.27%，RSD為2.3%。說明此方法的回收率較好。可用于檢測乙型腦炎減毒活疫苗中的慶大霉素(表2）。

表3 日內精密度的測定

表4 日間精密度的測定

表5 12批乙型腦炎減毒活疫苗中慶大霉素的含量

2.4 慶大霉素在乙型腦炎減毒活疫苗中的精密度檢測

取含標準慶大霉素含量為0.15、1.5、5ng/mL的低中高3種濃度的乙型腦炎減毒活疫苗的標準品溶液，進行吸光度的測定，每個樣品重復測定3次，計算日內精密度；連續測定3d，計算日間精密度。通過測定和計算得到日內精密度的RSD為2.92%(n=3)，表明此方法的日內精密性良好。日間精密度的RSD為2.46%(n=3)，表明此方法的日間精密性良好,結果見表3和表4。

2.5 乙型腦炎減毒活疫苗中慶大霉素含量的測定

將12批1人份規格的和5人份規格的乙型腦炎減毒活疫苗進行10倍稀釋，并按上述方法測定乙型腦炎減毒活疫苗中慶大霉素的含量。測得1人份規格的12批乙型腦炎減毒活疫苗的測定范圍為10.11～14.6ng/mL，平均值為12.32ng/mL；5人份規格的12批乙型腦炎減毒活疫苗的測定范圍為3.08～6.14ng/mL，4.87ng/mL。結果見表5，RSD均＜10%，說明同一劑量不同批號間的乙型腦炎減毒活疫苗所含有的慶大霉素量比較穩定，各個批次間差異較小，用于疫苗中抗生素含量的測定，其適用性較好(表5）。

3 討論

抗生素殘留量的檢測常用3種方法[8]：微生物學方法、免疫分析方法和理化方法。傳統的微生物檢測法特異性差，易被非抗生素抑菌劑所影響；而免疫分析方法具有操作時間短、特異性好、速度快、操作誤差小等特點，以至于得到了廣泛的應用。在乙型腦炎減毒活疫苗生產過程中加入了多種物質，成分復雜，不僅有病毒液，還加入了穩定劑，這些成份有可能對抗生素含量的測定存在干擾。文獻報道[9～10]慶大霉素采用試劑盒的方法其檢測限度可達到0.1ng/mL，但在使用試劑盒檢測時，疫苗穩定劑明顯干擾慶大霉素的測定。然而通過使疫苗稀釋的辦法可減小其測定的干擾。因此本文通過采用ELISA試劑盒并稀釋疫苗的方法對抗生素進行檢測，使疫苗中各成分得到稀釋以減少其含量測定的干擾[10～11]。通過此方法所得的回收率較高(96.27%，RSD為2.3%)，線性良好(0.1～8ng/mL，R2=0.9974)，試驗內和試驗間精密度的RSD也均＜10%，精密性好。實驗中檢測了1人份規格和5人份規格的乙型腦炎減毒活疫苗各12批，測得慶大霉素含量的平均值分別為12.32ng/mL(RSD=2.35%)和4.87ng/mL(RSD=1.82%)，表明同一劑量不同批號間乙型腦炎減毒活疫苗所含的慶大霉素量變化不大。

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