結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)小鼠樹突狀細(xì)胞凋亡及caspase-3、-8活化對(duì)凋亡的影響

朱逢佳，姚揚(yáng)偉，徐水凌，葉偉琴，蔡玉節(jié)

結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)小鼠樹突狀細(xì)胞凋亡及caspase-3、-8活化對(duì)凋亡的影響

朱逢佳1，姚揚(yáng)偉2，徐水凌1，葉偉琴1，蔡玉節(jié)1

(1.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，浙江嘉興314001;2.嘉興市第二醫(yī)院呼吸科，浙江嘉興314000)

目的：研究結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)誘導(dǎo)小鼠樹突狀細(xì)胞株(DC 2.4)凋亡及caspase-3、-8活化對(duì)凋亡的影響。方法：建立小鼠樹突狀細(xì)胞DC 2.4的人結(jié)核分枝桿菌H37Rv細(xì)胞混合培養(yǎng)模型。采用DAPI熒光染色法和透射電鏡分析凋亡DC 2.4細(xì)胞的形態(tài)特征;通過DNA瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA片段化分析，F(xiàn)ITC-Annexin V/PI熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC 2.4細(xì)胞凋亡情況;分光光度法檢測(cè)H37Rv誘導(dǎo)DC 2.4細(xì)胞凋亡過程中caspase-3、-8活性變化。結(jié)果：H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)2 h后，即有細(xì)菌侵入，培養(yǎng)4、6、8、10、12 h后，細(xì)菌侵入現(xiàn)象更明顯，侵入率分別為(16.1 ±4.3)%、(35.8 ±5.1)%、(50.2 ±5.7)%、(58.3 ±6.2)%和(65.9±6.9)%。H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)6 h后，DAPI染色熒光顯微鏡、透射電鏡觀察均發(fā)現(xiàn)DC 2.4細(xì)胞發(fā)生凋亡并出現(xiàn)典型的凋亡特征——染色質(zhì)濃縮及邊緣現(xiàn)象;DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)特征性的凋亡條帶。H37R與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)6 h、12 h和24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(6.4 ±2.5)%，(11.8 ±5.3)%和(31.1 ±8.7)%。caspase-3、-8 活性增高，caspase-3 活性于10 h達(dá)高峰(2.01 ±0.09)U/μg，而 caspase-8 活性則在 6 h 達(dá)高峰(2.40 ±0.07)U/μg，兩者與對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且caspase-8激活先于caspase-3。結(jié)論：結(jié)核分枝桿菌可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞發(fā)生凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與caspase-3、-8活化有關(guān)。

樹突狀細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;結(jié)核分枝桿菌;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

［J Zhejiang Univ(Medical Sci)，2011，40(5):515-521.］

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病，已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。目前，隨著Mtb耐藥菌株的不斷增加以及HIV與Mtb的雙重感染，使結(jié)核病控制形勢(shì)更趨嚴(yán)峻［1］。由于Mtb屬胞內(nèi)寄生菌，其產(chǎn)生的免疫主要以細(xì)胞免疫為主，樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)作為主要的抗原遞呈細(xì)胞，在機(jī)體抗結(jié)核病保護(hù)性免疫中起著重要的作用，深入了解Mtb感染機(jī)體過程中樹突狀細(xì)胞是否發(fā)生凋亡、凋亡發(fā)生的時(shí)機(jī)及機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步闡明結(jié)核病的免疫發(fā)生機(jī)制和為結(jié)核病治療提供新方法具有重要意義。本研究建立了小鼠樹突狀細(xì)胞株DC 2.4的結(jié)核分枝桿菌混合培養(yǎng)模型，采用DAPI熒光染色法和透射電鏡分別觀察Mtb與DC 2.4細(xì)胞株混合培養(yǎng)后細(xì)胞的核型變，DNA瓊脂糖凝膠電泳分析感染后的DC 2.4細(xì)胞株的凋亡情況，分光光度法檢測(cè)Mtb誘導(dǎo)DC 2.4細(xì)胞株凋亡過程中caspase-3、-8的活性變化，以期了解結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的凋亡狀況及相關(guān)信號(hào)途徑。

1 材料和方法

1.1 菌株、細(xì)胞株及主要試劑 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv株(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室惠贈(zèng);小鼠樹突狀細(xì)胞株DC 2.4由浙江大學(xué)免疫研究所惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)并保存。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胰酶(trypsin)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自杭州四季青生物制品有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Ameresco公司;細(xì)胞凋亡DAPI染色試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、caspase-3、-8分光光度法檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和H37Rv株懸液制備 將小鼠樹突狀細(xì)胞DC 2.4置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。H37Rv株接種于改良羅氏固體培養(yǎng)基，經(jīng)37℃孵育3周后，挑取生長(zhǎng)良好的H37Rv株于磨菌器中，加入含體積分?jǐn)?shù)為0.05%Tween-80的生理鹽水研磨15 min，無菌PBS(pH 7.4，0.01 mol/L)洗2次，2 500 r/min 離心10 min;然后，將其重懸于不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，調(diào)整其細(xì)菌密度為5.2 ×107CFU/ml，備用。

1.3 H37Rv與DC 2.4細(xì)胞株混合培養(yǎng) 取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔置一蓋玻片(0.8 cm×0.8 cm)，分別接種 DC 2.4 細(xì)胞(5.0 ×105個(gè)/ml)各 1 ml，于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入2 ml RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，無抗生素)，分別孵育2 h。小心吸棄培養(yǎng)液，按細(xì)菌∶細(xì)胞=100∶1的比例，每孔加入 H37Rv懸液 1 ml(濃度為 5.2×107CFU/ml)，37℃分別孵育0、2、4、6、8、10 和 12 h時(shí)，用PBS沖洗3次，取出蓋玻片，以-20℃預(yù)冷的細(xì)胞固定液固定 3 min，PBS洗 2次，Giemsa染色、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。同時(shí)，于混合培養(yǎng)的 0、2、4、6、8、10 和 12 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入250μl 0.1%Triton X-100，于 37℃ 裂解細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察DC 2.4細(xì)胞的裂解情況，待細(xì)胞全部裂解后每孔加入RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，無抗生素)500μl終止裂解，混勻后每孔分別做1∶10和1∶100稀釋，并接種于羅氏培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)18 d，計(jì)數(shù)各時(shí)間點(diǎn)H37Rv菌落總數(shù)(CFU)，同時(shí)計(jì)算不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)菌侵入率。細(xì)菌侵入率(%)=不同培養(yǎng)時(shí)間的H37Rv菌落總數(shù) /培養(yǎng)前H37Rv菌落總數(shù) ×100%［2］。

1.4 DAPI染色和透射電鏡觀察H37Rv誘導(dǎo)DC 2.4細(xì)胞凋亡 按上述培養(yǎng)方法，于混合培養(yǎng)0、2、6、12、24 h 時(shí)，小心取出蓋玻片，PBS 洗3次，4% 多聚甲醛固定 15 min，再用 0.1%Triton X-100破膜30 min，加入10μl DAPI和150μl 1%BSA/PBS混勻液，37℃恒溫箱孵育40 min，丙三醇/PBS封片，在熒光顯微鏡下觀察DC 2.4細(xì)胞核形態(tài)改變。于各混合培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，小心刮下與人H37Rv懸液混合培養(yǎng)的DC 2.4細(xì)胞(2 500 r/min 離心 10 min)，棄上清，沉淀物用2.5%(V/V)戊二醛4℃固定2 h，PBS洗3次，餓酸再固定，丙酮脫水，樹脂包埋，超薄切片后鉛鈾染色，透射電鏡下觀察DC 2.4細(xì)胞凋亡的核型變化。

1.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析 收集上述混合培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的 DC 2.4細(xì)胞，各約5.0×105個(gè)，經(jīng)PBS洗滌后，按凋亡細(xì)胞DNA Ladder檢測(cè)試劑盒提供的操作步驟提取細(xì)胞總DNA。2%瓊脂糖凝膠在100 V下電泳約1.5 h，凝膠成像分析儀觀察并記錄結(jié)果。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集上述混合培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的DC 2.4細(xì)胞，PBS洗3次，然后分別用Annexin V FITC和Propidium iodide(PI)染色，按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說明書，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各時(shí)間段的細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置未與H37Rv懸液混合培養(yǎng)的DC 2.4細(xì)胞為對(duì)照。

1.7 caspase-3和caspase-8活性檢測(cè) 按上述方法收集與H37Rv混合培養(yǎng)的DC 2.4細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞(各約為5.0×105個(gè)，于50μl冷凍裂解緩沖液中，按caspase-3、-8分光光度法檢測(cè)試劑盒說明書操作。各組樣品加樣至96孔培養(yǎng)板，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)A405nm值，檢測(cè)波長(zhǎng)為405 nm時(shí)caspase-3、-8的活性變化(酶活性以U/μg表示)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以ˉx±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，細(xì)胞侵入率比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H37Rv與 DC 2.4混合培養(yǎng) H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)2 h后，即有細(xì)菌侵入，侵入率為(8.7 ±1.1)%，培養(yǎng)4、6、8、10 和12 h 后，DC 2.4 細(xì)胞的侵入率分別為(16.1 ±4.3)%、(35.8 ±5.1)%、(50.2 ±5.7)%、(58.3 ±6.2)%和(65.9±6.9)%，與混合培養(yǎng)2 h相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。混合培養(yǎng)組可見H37Rv黏附于細(xì)胞表面，有部分H37Rv侵入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)可見中毒顆粒，隨著混合培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，此現(xiàn)象更加明顯(圖1)。

表1 H37Rv對(duì)DC 2.4細(xì)胞的侵入率Table 1 Invasion rates of DC 2.4 cell lines induced by H37Rv(n=4，ˉx±s，%)

圖1 人結(jié)核分枝桿菌H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 Effects of H37Rv strain co-cultured with DC 2.4 cells

2.2 DAPI染色和透射電鏡觀察結(jié)果 DAPI染色結(jié)果顯示，H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)6 h后，DC 2.4細(xì)胞核逐漸出現(xiàn)固縮，染色質(zhì)聚集、邊緣化等典型的細(xì)胞凋亡核形態(tài)學(xué)改變，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡核形態(tài)學(xué)改變?cè)矫黠@;而對(duì)照組DC 2.4細(xì)胞核呈淡藍(lán)色的圓形或橢圓形，染色質(zhì)無濃縮及波紋狀出現(xiàn)(圖2)。透射電鏡也發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)混合培養(yǎng)的DC 2.4細(xì)胞胞核較大，胞核染色質(zhì)分布均勻，無染色質(zhì)集聚現(xiàn)象;而H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)24 h后，DC 2.4細(xì)胞胞核體積變小，染色質(zhì)呈高度凝聚、邊緣化(圖3)。

圖2 人結(jié)核分枝桿菌H37Rv誘導(dǎo)DC 2.4細(xì)胞凋亡熒光顯微鏡觀察Fig.2 Apoptosis of DC 2.4 cells induced by H37Rv under fluorescence microscopy

圖3 H37Rv誘導(dǎo)DC 2.4細(xì)胞凋亡透射電鏡觀察Fig.3 Apoptosis of DC 2.4 cells induced by H37Rv under TEM

2.3 DC 2.4細(xì)胞凋亡的DNA片段化分析DNA瓊脂糖凝膠電泳分析表明，對(duì)照組細(xì)胞和混合培養(yǎng)2 h細(xì)胞，未見有特征性的DNA梯狀條帶(DNA Ladder)出現(xiàn);而 H37Rv與 DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)6、12、24 h后，DNA降解成特征性的梯狀條帶;且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，DNA梯狀條帶逐漸明顯(圖4)。結(jié)果顯示H37Rv混合培養(yǎng)6 h時(shí)，即可誘導(dǎo)DC 2.4細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC 2.4細(xì)胞的凋亡 流式細(xì)胞儀結(jié)合Annexin V-FITC標(biāo)記法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，H37Rv與 DC 2.4 細(xì)胞混合培養(yǎng) 2、6、12、24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(4.6 ±1.8)%、(6.4 ±2.5)%、(11.8 ± 5.3)% 和(31.1 ± 8.7)%，其中H37Rv混合培養(yǎng)6、12、24 h組凋亡率顯著高于對(duì)照組(2.8 ±1.1)%(P ＜0.05，圖 5)。

圖4 H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 DNA agarose gel electrophoresis analysis of H37Rv co-cultured with DC 2.4 cells

2.5 caspase-3、-8活性變化 H37Rv與 DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)6 h后，caspase-3活性開始增高，于10 h 達(dá)高峰(2.01 ±0.09)U/μg ，隨后逐漸下降;而caspase-8活性則在H37Rv混合培養(yǎng)4 h 后，即達(dá)高峰(2.40 ±0.07)U/μg，此后，caspase-8活性逐漸下降。與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

3 討論

圖5 不同培養(yǎng)時(shí)間DC 2.4細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率Fig.5 Apoptosis rates of DC 2.4 cells induced by H37Rv

作為胞內(nèi)寄生菌的結(jié)核分枝桿菌，可通過其胞壁上的特殊脂質(zhì)、糖脂和多糖組成的附加層，以及脂質(zhì)阿拉伯甘聚糖和阿拉伯半乳糖等細(xì)胞壁成分，長(zhǎng)期存活在宿主巨噬細(xì)胞中，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。研究表明，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡是不少病原微生物重要的致病機(jī)制，Mtb侵入宿主的巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞并不是立即壞死，而是出現(xiàn)細(xì)胞凋亡［3-5］。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，被Mtb感染的巨噬細(xì)胞可以發(fā)生凋亡，且不同毒力的Mtb在不同的感染時(shí)間顯示出誘導(dǎo)凋亡的能力也有所不同，從而提示巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌的主要抗原遞呈細(xì)胞及殺滅胞內(nèi)細(xì)菌的效應(yīng)細(xì)胞［6］。樹突狀細(xì)胞作為體內(nèi)重要的抗原遞呈細(xì)胞，在抗結(jié)核免疫中起著始動(dòng)者作用，Mtb是否侵入宿主的樹突狀細(xì)胞，以及能否誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞發(fā)生凋亡，值得深入研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)，H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)2 h后，即見有H37Rv的侵入，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)菌侵入率也隨之增高。DAPI染色和透射電鏡結(jié)果顯示，當(dāng)H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)6 h后，DC 2.4細(xì)胞核逐漸出現(xiàn)固縮，染色質(zhì)聚集、邊緣化等典型的細(xì)胞凋亡核形態(tài)學(xué)改變;DNA瓊脂糖凝膠電泳分析表明，H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)6 h后，DNA降解成特征性的梯狀條帶;流式細(xì)胞儀結(jié)合Annexin V-FITC標(biāo)記法檢測(cè)結(jié)果也顯示，H37Rv與 DC 2.4 細(xì)胞混合培養(yǎng)6，12，24 h 后，細(xì)胞凋亡率分別為(6.4 ±2.5)%，(11.8 ±5.3)%和(31.1 ±8.7)%，細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組的(2.8±1.1)%(P ＜0.05)。從而提示，H37Rv在與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)早期，即可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞發(fā)生凋亡。我們推測(cè)，這種在混合培養(yǎng)早期即產(chǎn)生的凋亡作用，可能對(duì)有效地控制Mtb在胞內(nèi)的生存、繁殖和擴(kuò)散有著重要的意義。有研究表明，結(jié)核分枝桿菌可通過菌體表面的19 kD脂蛋白，特異性地與巨噬細(xì)胞膜表面的Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)結(jié)合，從而觸發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡［7］。結(jié)核分枝桿菌對(duì)樹突狀細(xì)胞是否也具有相同的作用，尚需進(jìn)一步證實(shí)。

表2 H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)不同時(shí)間段caspase-3、-8活性變化Table 2 Effects of H37Rv on activities of caspase-3 and-8 in DC 2.4 cells at different time(n=4，ˉx±s，U·μg-1)

眾所周知，細(xì)胞凋亡過程中，caspase家族的激活起著關(guān)鍵作用。caspase家族蛋白屬于絲氨酸/半胱氨酸家族，存在于細(xì)胞漿中，組成細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)通路。caspase一般以無活性的蛋白酶原形式存在，在蛋白酶水解被激活后會(huì)啟動(dòng)凋亡事件的發(fā)生［8-9］。通常將caspase家族分為細(xì)胞凋亡的起始者(caspase-2/-8/-9)和執(zhí)行者(caspase-3/-6/-7)，且兩者之間存在著上下游關(guān)系，即起始者活化執(zhí)行者。caspase-8與caspase-3在caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中分別在起始者與執(zhí)行者上處于核心地位，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵及凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H37Rv與DC 2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)4 h后，caspase-3活性即開始增高，于10 h達(dá)高峰;而caspase-8活性則在H37Rv混合培養(yǎng)6 h后，即達(dá)高峰，此后逐漸下降。由此我們推測(cè)，人型結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株誘導(dǎo)DC 2.4細(xì)胞發(fā)生的凋亡，可能是通過先活化caspase-8，繼而再活化caspase-3來完成的。至于其凋亡的具體信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，還有待于進(jìn)一步的研究。

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Effects of Mycobacterium tuberculosis on apoptosis of mouse dendritic cells and activation of caspase-3，caspase-8

ZHU Feng-jia，YAO Yang-wie，XU Shui-ling，YE Wei-qin，CAI Yu-jie(Department of Medical Microbiology and Parasitology，Medical School of Jiaxing College，Jiaxing 314001，China)

Objective:To investigate the effects of Mycobacterium tuberculosis on apoptosis of mouse dendritic cells(DC 2.4)and the activation of caspase-3，caspase-8.Methods:Mycobacteriumtuberculosis H37Rv strain was co-cultured with DC 2.4 cells.The morphological changes of DC 2.4 cells were observed with fluorescence microscope after DAPIstaining and transmission electron microscope.The apoptosis of DC 2.4 cells were examined by DNA agarose gel electrophoresis.The activities of caspase-3 and caspase-8 were detected by colorimetric assay.Results:Bacterial invasion was observed while DC 2.4 cells and H37Rv were co-cultured for 2 h;and the rates of invasion were(16.1 ±4.3)%，(35.8 ±5.1)%，(50.2 ± 5.7)%，(58.3 ± 6.2)%and(65.9 ± 6.9)%at 4，6，8，10，12 h，respectively.The phenomenon of nuclear condensation and marginalization were shown by DAPI staining and transmission electron microscope in DC 2.4 cells at 6 h of co-cultivation with H37Rv.The characteristic bands of apoptosis by DNA electrophoresis were detected.The activities of caspase-3 and caspase-8 were increased in a time-dependent manner.The rates of DC 2.4 cell apoptosis were(6.4 ± 2.5)%，(11.8 ± 5.3)%and(31.1 ± 8.7)%at 6 h，12 h and 24 h after co-cultivation with H37Rv，respectively.The maximal activities of intracellular caspase-3 and caspase-8 at 10 h and 6 h were(2.01 ±0.09)U/μg and(2.40±0.07)U/μg，respectively，which was significantly different compared with the control groups(P ＜0.05).The activation of caspase-8 was earlier than that of caspase-3.Conclusion:Mycobacterium tuberculosis can induce the apoptosis of DC 2.4 cells，which is associated with the activation of intracellular caspase-3 and caspase-8.

Dendritic cells;Apoptosis;Mycobacterium tuberculosis;Caspases

R 394.2

A

1008-9292(2011)05-0515-07

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2011.05.009

2011-03-16

2011-05-23

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目基金資助項(xiàng)目(851909107);嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011AY1048-2).

朱逢佳(1989-)，女，本科生.

徐水凌(1964-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)菌分子和細(xì)胞致病機(jī)制的研究;E-mail:xu.shuiling@mail.zjxu.edu.cn

［責(zé)任編輯 黃曉花］