靶向抑制CXCR7基因表達對結腸癌生長的影響

王紅鮮 陶霖玉 齊 柯 張好云 馮 鐸 孔 恒 林秋生 陳天文

趨化因子及其受體家族在腫瘤的增殖、轉移過程中扮演重要角色。CXCR7，以前稱“孤兒G蛋白偶聯受體(RDC1)”，屬于趨化因子受體家族，是一條肽鏈的7-跨膜受體，與趨化因子-12(CXCL12)具有高親和力，表達于許多腫瘤細胞系，直接參與調節腫瘤的發生發展[1]。

分子靶向治療是抗腫瘤特異性治療的最高層次。以細胞惡變的分子事件為治療靶點，從分子水平來逆轉腫瘤的惡性生物學行為，抑制腫瘤細胞生長，或阻斷細胞惡變的基礎和環境[2,3]，從根本上動搖和消滅腫瘤的方法和策略，已經受到學術界的廣泛關注。本文采用RNA干擾的方法，通過構建人結腸癌荷瘤裸鼠動物模型，在瘤體內多點注射CXCR7的重組慢病毒shRNA表達載體，觀察其對荷瘤裸鼠瘤體生長的影響，探討體內靶向抑制CXCR7的表達對結腸癌的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c雌性4周齡裸鼠24只，體重12～14 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號SCXK(滬)2007-0005]，飼養于層流玻璃罩內，飼料及飲水均經滅菌處理。

1.2 細胞株

HT-29(人結腸癌細胞株)購自中南大學湘雅醫學院細胞中心，采用RPMI 1640完全培養基(含10％小牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，置5％CO2的37℃飽和濕度的培養箱內培養。

1.3 人CXCR7基因特異性RNAi慢病毒表達載體

設計人CXCR7基因(GeneBank，NM_020311)的siRNA靶點序列“gcagccggaagatcatcttct”(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/design.do)，并經Genebank數據庫BLAST檢索，確認無其它同源序列。合成CXCR7基因的shRNA片段(引物：Forward，5’-accacgcgtg gcagccggaagatcatcttctctctcttgaattc-3’；Reverse，5’-aaaatcgataaaaaa gcagccggaagatcatcttctgaattcaagagag-3’)，酶切shRNA互補雙鏈產生黏性末端，酶切plVTHM質粒(干擾質粒)使之線性化，37℃ 3h后電泳凝膠回收，采用T4連接酶連接，既得plVTHM-CXCR7shRNA重組質粒。將慢病毒包裝的四質粒系統(plVTHM-CXCR7shRNA重組質粒，pRsv-Rev，pMDlg-pRRE和pMD2G)共轉染293T細胞，72 h后收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，并過濾、純化[2]。

1.4 人結腸癌動物模型的建立及分組

1.4.1 建立人結腸癌荷瘤裸鼠動物模型 常規胰酶消化生長狀態良好的人結腸癌細胞株HT-29，制成單細胞懸液，800 rpm/min離心5 min，PBS液清洗并重懸細胞，調整細胞濃度至2.5×107/ml。

用1 ml注射器吸取HT-29細胞(約0.2 ml，含5×106個細胞)，接種于每只裸鼠背部皮下(注意勿接種到皮內)，1周左右100％成瘤(成瘤標準：瘤體直徑超過0.5 cm)。

1.4.2 動物分組 將人結腸癌荷瘤裸鼠隨機分為3組，每組8只，進行瘤體內多點注射給藥。治療組：50 μl LV-CXCR7shRNA(4×108TU/ml)；陰性對照組：50 μl LV-shRNA negative control(4×108TU/ml)；空白對照組：50 μl PBS。

1.5 給藥后24天瘤體的體積與重量

人結腸癌荷瘤鼠瘤體內給藥后第24天，用游標卡尺測量腫瘤的最長徑(a)和與之垂直的最短徑(b)，根據公式計算瘤體體積(V)：V=ab2×0.52(cm3)[3]。之后拉頸處死裸鼠，剝離皮下腫瘤，稱取瘤體重量。

1.6 Western blotting測定給藥后24天各組CXCR7蛋白表達

常規RIPA及PMSF提取各組荷瘤鼠瘤體總蛋白，取等量變性蛋白樣品于SDS-PAGE膠中電泳，在Bio-Rad半干式電轉儀中轉至硝酸纖維素膜上，5％脫脂奶粉-PBST封閉非特異蛋白。用一抗(1∶500稀釋兔抗CXCR7，1∶1 000稀釋兔抗GAPDH)室溫孵育2 h，洗膜后再用二抗(1∶1 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP)室溫孵育2 h，ECL顯色、曝光顯影，Gene Genius凝膠成像系統成像，Quantity One 4.62(Bio-Rad)凝膠分析軟件測定各條帶的光密度值，結果以積分光密度值(integral optical density，IOD)表示，以IODCXCR7/GAPDH作為CXCR7蛋白的相對量。

1.7 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件，統計數據用均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用S-N-K法，P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 瘤體內給藥后的腫瘤體積

在人結腸癌荷瘤裸鼠瘤體內給藥后第24天，所有動物均存活。與2組對照組比較，治療組瘤體體積顯著縮小(P<0.05)；陰性對照組和空白對照組比較無顯著性差異(P<0.05)，見表1，結果表明靶向抑制CXCR7的表達，可使人結腸癌荷瘤鼠的瘤體生長顯著受抑。

表1 各組荷瘤鼠瘤體體積(±s)

表1 各組荷瘤鼠瘤體體積(±s)

組別n體積F值P值治療組80．90±0．1414．040．00陰性對照組81．35±0．23空白對照組81．42±0．17

2.2 瘤體內給藥后24天的瘤重

拉頸處死荷瘤裸鼠，大體解剖未發現遠處轉移灶，剝離皮下腫瘤，測量瘤體的重量，結果發現治療組瘤重顯著輕于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)；陰性對照組和空白對照組比較差異無顯著性(P>0.05)，見表2和圖1，提示慢病毒CXCR7shRNA表達載體能明顯抑制瘤體生長。

圖1 各組荷瘤鼠的瘤體組織

a1,a2為治療組； b1,b2為陰性對照組； c1,c2為空白對照組

表2 各組荷瘤鼠瘤體重量(±s)

表2 各組荷瘤鼠瘤體重量(±s)

組別n瘤重F值P值治療組80．39±0．134．9570．017陰性對照組80．63±0．19空白對照組80．58±0．17

2.3 瘤體組織中CXCR7蛋白表達水平

在大小約52 kD(目的蛋白CXCR7)和37 kD(內參蛋白GAPDH)處，各組織標本均有特異性條帶(圖2)。治療組CXCR7蛋白表達水平低于陰性對照組和空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(因液氮凍存罐炸裂，數個標本丟失，故每組均等取6個標本)；陰性對照組和空白對照組比較無統計學差異(P>0.05)，見表3和圖2，提示瘤體內注射靶向CXCR7的shRNA慢病毒表達載體，能有效降低荷瘤裸鼠瘤體組織中CXCR7蛋白的表達水平。

圖2 Western blotting檢測CXCR7蛋白表達

表3 Western blotting檢測各組中CXCR7蛋白表達

3 討論

結腸癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發生發展過程涉及一系列分子事件，趨化因子CXCL12及其受體CXCR4的異常表達是結腸癌生長和轉移的關鍵因素[4]。CXCR7是近年發現與CXCL12具有高親和力的受體[5]。研究發現，趨化因子受體CXCR7在許多人類惡性腫瘤中呈高表達，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等，且隨腫瘤侵襲性的增加而表達量增多，但在正常組織標本中不表達或少表達[6]。S Iwakiri[7]研究發現，高表達CXCR7的Ⅰ期非小細胞性肺癌患者術后復發率顯著增高、5年無瘤生存率明顯降低。

體外實驗證實CXCR7能提高腫瘤細胞的生長、黏附和侵襲能力[8～10]，CXCR7在體內是否參與調控腫瘤的發生發展？Burns[5]在小鼠腫瘤模型的研究中發現，CXCR7能調節惡性腫瘤的生物學性質，促進腫瘤進展。有學者用CXCR7的小干擾RNA(small interference ribonucleic acid,siRNA)，使CXCR7在乳腺癌細胞株4T1中表達減少到10％，體內成瘤性顯著降低[9]；將CXCR7序列導入乳腺癌細胞MDA-MB435s，體內成瘤性顯著提高[9,11]；自小鼠尾靜脈分別注射上述2種轉染了CXCR7基因序列的腫瘤細胞，其肺部的轉移、侵襲能力顯著增加[9]。Burns等[5]從約10萬個小分子化合物中篩選出2個CXCR7拮抗劑，將表達CXCR7的腫瘤細胞接種至小鼠，同時給予拮抗劑處理，結果發現接受拮抗劑處理的小鼠，其腫瘤的生長趨勢顯著降低。值得關注的是轉導CXCR7的正常細胞有惡性轉化潛能，將CXCR7導入小鼠成纖維細胞NIH-3T3能促進其增殖和成瘤[9]。BKSHV(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus)與人淋巴細胞增生性疾病和卡波肉瘤密切相關，裸鼠體內實驗顯示CXCR7的siRNA能抑制KSHV感染所致的細胞惡性轉化[12]。上述結果提示CXCR7在惡性腫瘤的演變過程中可能發揮重要作用。

探討CXCR7對結腸癌生物學性質的調控，有望為惡性腫瘤的治療提供了一個新的策略。本文以人結腸癌荷瘤裸鼠為研究對象，以CXCR7為分子靶標，以shRNA重組慢病毒載體為治療介質，研究靶向沉默CXCR7基因的表達對人結腸癌荷瘤裸鼠瘤體生長的影響，結果發現瘤體的體積顯著減小、重量顯著減輕，CXCR7的靶向沉默效應經Western blotting檢測予以證實，提示靶向抑制CXCR7基因的表達能顯著抑制人結腸癌荷瘤裸鼠的瘤體生長，CXCR7可能參與促進結腸癌的惡性進展，是人結腸癌治療潛在的分子靶標。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)誘發的轉錄后基因靜默機制，即同源性mRNA的降解，是研究基因功能、探討藥物治療靶標的有力工具[13,14]。siRNA是RNAi的效應分子[15]，但其穩定性較差，容易被核酸酶降解，且不易透過生物膜。慢病毒以其轉染效率高、能將遺傳物質整合到靶細胞基因組、可持續性表達等優勢，為RNAi提供高效、安全、穩定的表達載體。本文采用慢病毒介導的RNA干擾方法，從實驗動物水平探討CXCR7與人結腸癌的關系，以期為結腸癌的治療帶來新的方案。本文針對CXCR7基因序列設計的siRNA序列進行了嚴格的BLAST比對，以保證和其他基因的非同源性，提高對CXCR7靶基因沉默的特異性。

CXCR7的信號傳導及其對腫瘤調節機制尚不確切。推測其信號傳導可能是通過結構性激活機制來活化細胞，此結構性激活機制通過可逆性地與配體結合的形式活化。有報道[8]CXCR7參與上調TGF-β1(transforming growth factor-β1)的表達，后者可誘導上皮細胞向間葉細胞轉化，這與腫瘤的發生發展關系密切。配體活化的CXCR7還可能激活AKT信號傳導通路，有利于腫瘤生長。此外，CXCR7可能誘導白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)和血管內皮生長因子(vessel endothelium growth factor,VEGF)表達，參與調控腫瘤血管生成。趨化因子及其受體所調節的腫瘤生長微環境比以往的認識要復雜得多，值得學術界進一步探索發現。

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[9]Balabanian K,Lagane B,Infantino S,et al.The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes〔J〕.J Biol Chem,2005,280(42):35760.

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