紫杉醇誘導人膀胱癌EJ細胞凋亡及與Bcl-2基因表達的關系

郭春龍 朱曉敏 曲世靜 姜華茂

1962年,在紫杉屬的植物提取物中，發現具有抗白血病和其它一些腫瘤的作用。1971年鑒定了這種提取物中具有抗癌活性的成分是紫杉醇(Paclitaxel,taxol)后，其研究日漸深入。一般認為紫杉醇作用的靶位點主要是微管蛋白/微管系統，促進微管聚合，抑制微管降解，使細胞分裂周期阻滯在G2/M期，最終導致細胞凋亡[1～3]。

近年來，國內、外已有報道紫杉醇誘導肺癌、食管癌、乳腺癌、白血病[4,5]細胞凋亡，但有關紫杉醇誘導膀胱癌細胞凋亡的報道目前尚少。本研究以人膀胱癌EJ細胞株為靶細胞，觀察在不同濃度的紫杉醇作用后，細胞凋亡和bcl-2基因表達的改變，探討其可能作用機制，為紫杉醇用于膀胱癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌EJ細胞株購自上海午立生物有限公司；紫杉醇注射液(規格：30 mg/5 ml，批號2004100211ED)購自上海華聯制藥有限公司； 100 bp DNA leader購自美國promega公司。

1.2 儀器設備

流式細胞儀(美國B.D公司)；熒光顯微鏡(Olympus，日本)；酶聯免疫檢測儀(DG3022A型，中國)；細胞圖像分析儀(CIAS—1000型，中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 對照組：不加入紫杉醇，每天更換RPMI-1640培養液。實驗組：紫杉醇濃度分別為1、10、100、1 000 nmol/L。接種細胞24 h進入對數生長期后開始加藥，每天換液以維持藥物濃度恒定。

1.3.2 流式細胞儀檢測 采用PI單染法[6],對實驗細胞進行流式細胞儀上樣分析，激發波長488 nm紅色熒光，測定各期細胞DNA含量及細胞凋亡率。

1.3.3 bcl-2原位雜交檢測 取對數生長期的膀胱癌EJ單細胞懸液5×105個,接種于含有載玻片的底面積為8 cm2的培養皿中。24 h后更換培養液，并加處理因素，培養48 h。用0.1MPBS(pH7.4)洗2 min×3次。針對人bcl-2靶基因進行原位雜交試驗，倒置顯微鏡下觀察結果并拍照，于細胞圖像分析儀下進行統計分析。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測結果

不同濃度的紫杉醇作用24、48 h后，對EJ細胞作用結果見表1、圖1、圖2。

表1 紫杉醇作用后EJ細胞的凋亡情況(n=5,±s，％)

表1 紫杉醇作用后EJ細胞的凋亡情況(n=5,±s，％)

組別凋亡率24h48h對照組2．15±0．392．37±0．40紫杉醇1nmol/L2．78±0．452．88±0．49紫杉醇10nmol/L4．88±0．89??6．43±0．57??△紫杉醇100nmol/L10．22±1．23??15．36±1．33??△△紫杉醇1000nmol/L18．11±1．59??28．08±1．39??△△

注：與對照組比較，*為P<0.05，**為P<0.01；與作用24 h比較，△為P<0.05，△△為P<0.01

由表1可見，紫杉醇濃度為1 nmol/L時，與對照組比較細胞凋亡率無顯著性差異，隨作用時間延長細胞凋亡率也無顯著性差異。紫杉醇濃度>10 nmol/L以上時,與對照組比較,細胞凋亡率有顯著性差異，且隨作用時間的延長，細胞凋亡率也明顯增高。

圖1 不同濃度紫杉醇作用24 h時的流式細胞儀結果

圖2 100 nmol/L紫杉醇不同作用時間的流式細胞儀結果

流式細胞儀檢測DNA圖上出現低于G1期DNA含量的亞二倍體峰，為細胞凋亡峰，峰下面積即為細胞凋亡率，圖1A為對照組的流式細胞儀檢測結果，可見未加紫杉醇的EJ細胞也有少量細胞發生凋亡，由圖1中可以看出正常生長狀態下的EJ細胞大多數處于G1期，S期次之，G2/M期最少。紫杉醇>10 nmol/L以上組細胞周期阻滯于G2/M期，隨著紫杉醇濃度的增加，G2/M峰逐漸增高，另外，G1期前出現多個因壞死所致低平小峰，且低平小峰隨紫杉醇作用時間延長而增多增高，但無論作用時間如何延長都不會出現凋亡峰。圖1顯示，紫杉醇作用時間相同的情況下，細胞凋亡峰隨紫杉醇濃度的增大而增高。圖2為紫杉醇濃度為100 nmol/L時分別作用24 h和48 h，細胞凋亡峰均較高，說明紫杉醇濃度為100 nmol/L時能明顯誘導EJ細胞凋亡，且由圖可直觀看出48 h的凋亡峰要高于24 h，說明紫杉醇誘導細胞凋亡具有時間依賴性。

2.2 bcl-2原位雜交檢測結果

bcl-2基因表達于細胞胞質中，呈棕黃色，紫杉醇作用后EJ細胞體積縮小，胞質著色變淺，bcl-2基因在胞質中的表達明顯減弱。

應用細胞圖像分析儀，在每個濃度組隨機選取15個細胞，在每個高倍視野(×400倍)下測細胞的面積、圓形度和細胞胞質的灰度，見表2。

表2 紫杉醇作用下EJ細胞及Bcl-2基因表達的改變

注：與對照組比較 *為P<0.05，**為P<0.01

從表2中可以看出紫杉醇作用后，EJ細胞的面積縮小、圓形度增加、細胞變圓。紫杉醇作用后胞質中bcl-2基因表達也降低，說明紫杉醇可抑制bcl-2基因表達。

3 討論

流式細胞儀檢測DNA圖上出現低于G1期DNA含量的亞二倍體峰為細胞凋亡峰，峰下的面積即為細胞凋亡率。圖1A為對照組的流式細胞儀檢測結果，可知未加紫杉醇的EJ細胞也有少量發生凋亡。而紫杉醇濃度為100 nmol/L和1 000 nmol/L組凋亡率明顯增高，統計結果表明與對照組相比具有極顯著性差異。

本研究，流式細胞儀結合透射電鏡、瓊脂糖凝膠電泳結果[7]，能夠清楚看到紫杉醇有明顯誘導EJ細胞凋亡的作用。這與Frank等[8]的研究結果相一致。他們運用Annexin及PI復染法檢測凋亡，來區分早期凋亡、晚期凋亡和死亡，發現紫杉醇在較低濃度時便能誘導細胞凋亡。

流式細胞儀檢測結果可見，紫杉醇10 nmol/L以上組與對照組比較有非常顯著性差異，且隨紫杉醇濃度的增大細胞凋亡率也明顯增高。在10 nmol/L以上組，同一濃度下不同的作用時間細胞凋亡率也存在顯著性差異，作用時間長細胞凋亡率就高?？梢娮仙即颊T導EJ細胞凋亡具有明顯的時間-劑量依賴性。趙世義等[9]在紫杉醇誘導肝癌細胞中也得出了同樣結論。我們同時觀察到藥物濃度加大后(>1 000 nmol/L)壞死細胞逐漸增多。因此，我們認為從凋亡角度看誘導膀胱癌細胞凋亡應選擇合適的藥物濃度和作用時間，這樣既可以啟動膀胱癌細胞的“自殺”程序，又可使正常細胞避免因藥物過大劑量和超長作用時間帶來的損害，任意提高藥物濃度及延長作用時間對誘導膀胱癌細胞凋亡是無益的。

bcl-2原位雜交檢測結果顯示紫杉醇作用后，bcl-2在胞質中的表達明顯降低。細胞圖像分析儀統計結果也表明bcl-2的表達隨紫杉醇濃度的增大而降低，紫杉醇可抑制bcl-2基因的表達。bcl-2基因(即B細胞淋巴瘤/白血病-2基因)是1種原癌基因[10]。研究表明，bcl-2能夠抑制細胞的凋亡而促進細胞的生長，但是這種抑制機制目前仍不清楚[11]。研究發現紫杉醇誘導的細胞凋亡往往伴隨著bcl-2的磷酸化[12]。Haldar等[13]將白血病細胞用磷酸酶抑制劑處理后使bcl-2磷酸化，從而使細胞死亡，發現紫杉醇能誘導前列腺癌細胞的bcl-2磷酸化及細胞凋亡，不能誘導bcl-2缺陷株的凋亡。bcl-2能與bax形成異緣二聚體導致細胞凋亡，但bax的含量并沒有因紫杉醇的處理而發生變化，推測穩定微管和bcl-2磷酸化可能是紫杉醇和同一靶位點相作用的結果，也許是通過刺激絲氨酸蛋白激酶途徑[14]。Haldar等認為絲氨酸-70是紫杉醇誘導bcl-2磷酸化的一個重要作用位點，因為該位點被丙氨酸取代后，bcl-2的磷酸化被顯著抑制[15]。最近又有學者發現，Bcl-2上的一段60個氨基的環狀結構是bcl-2對抗紫杉醇誘導細胞凋亡的重要區域，因為bcl-2的磷酸化位點存在于該環中[16]。我們研究發現，bcl-2在膀胱癌EJ細胞中具有明顯的表達，紫杉醇可抑制bcl-2的表達，其誘導bcl-2的磷酸化可能為EJ細胞凋亡的作用機制之一。

紫杉醇被譽為近15年來發現的最主要的抗癌藥物，預測在今后10～15年內是抗癌的主要藥品之一[17]。我們的試驗表明紫杉醇通過抑制bcl-2基因的表達，具有明顯誘導膀胱癌EJ細胞凋亡的作用。紫杉醇用于膀胱癌的治療臨床上還處于試驗階段，如何選擇最佳的用藥劑量，減少紫杉醇化療的不良反應以及紫杉醇誘導膀胱癌細胞凋亡的機制還有待于進一步研究，相信紫杉醇將會成為治療膀胱癌非常有價值的1種藥物。

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