HIF-1α基因沉默對人肺腺癌細胞A549裸鼠移植瘤生長及survivin表達的影響

沈圓兵 陳余清 王效靜 李 偉 舒紅梅

前期體外實驗研究證實，HIF-1α和survivin在NSCLC中呈高表達，HIF-1α與survivin潛在啟動子結合上調survivin基因的轉錄活性，且對survivin啟動子的調控具有腫瘤特異性[1]。Li等[2]認為HIF-1α在不同腫瘤中對抑制腫瘤生長的效果不同，沉默HIF-1α的表達能否抑制肺癌的生長，且對survivin的表達是否有無影響，目前國內外未見此相關報道。因此，我們采用HIF-1α穩定轉染的Mi RNA質粒的A549細胞構建裸鼠移植瘤模型，觀察HIF-1α基因沉默對移植瘤生長及survivin表達的影響，進一步探討HIF-1α在肺癌發病中的分子機制，為肺癌靶向治療提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

荷瘤雄性裸鼠15只，4～6周齡，體重18～24 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，SPF環境下飼養。

1.2 主要試劑

分別轉染HIF-1α-Mi RNA、無意義序列Mi RNA，空質粒載體的A549細胞株由實驗室前期構建并保存，以含10％胎牛血清的HAMs-F12完全培養基培養；鼠抗人HIF-1α和鼠抗人survivin單克隆抗體購自Santa公司，逆轉錄及PCR試劑盒購自Fermentas公司；TUNEL檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 A549荷瘤鼠模型的建立及基因治療觀測 將裸鼠隨機分為3組，每組5只，收集處于對數生長期的3組A549細胞株[空白對照組、無意義序列轉染組和實驗組(穩定轉染HIF-1α-MiRNA的真核表達載體)],胎盤藍檢測細胞活力在90％以上，每只裸鼠背部皮下接種各組處理細胞懸液0.1 ml，每3 d測量1次腫瘤的長徑和短徑，根據公式(腫瘤體積=腫瘤長徑×腫瘤短徑2×0.52)計算腫瘤體積，觀察3組荷瘤鼠的腫瘤生長情況，接種60 d后，頸椎脫臼處死裸鼠，剝離腫塊并稱重，計算抑瘤率。

1.3.2 免疫組化染色 嚴格按照免疫組化SP試劑盒說明書進行操作，參照Couzin等[3]的細胞計數，用高倍視野(×400)計數500個細胞，陽性細胞率(％)=陽性細胞數/總細胞數×100％，HIF-1α和survivin陽性反應以胞質或胞核內見棕黃色顆粒。

1.3.3 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法半定量檢測腫瘤組織中HIF-1α、survivin mRNA的表達 收集各組組織細胞約6×106個，Trizol法提取細胞總RNA，以cDNA為模板，進行PCR反應，擴增HIF-1α、survivin片段。測定PCR產物cDNA條帶和GAPDH內參照條帶的吸光度(A)值的比值，作為HIF-1α、survivin mRNA的相對表達量。PCR反應的引物序列及產物大小見表1。

1.3.4 TUNEL法檢測細胞凋亡 按照碧云天TUNEL試劑盒說明書進行，熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞呈綠色熒光，高倍鏡(×400)下隨機選擇10個視野,計數凋亡細胞數量并計算平均值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 3組裸鼠的腫瘤生長情況

以皮下瘤體結節直徑>0.5 cm為接種成瘤標準，3組裸鼠成瘤率為100.0％，無1例死亡。由表2可見，皮下成瘤后3組腫瘤的生長趨勢無明顯區別，接種后第25天開始，空白對照組和無意義序列轉染對照組腫瘤體積均顯著大于實驗組(P均<0.05)，45天后具有顯著性差異(P<0.01)。接種后第60天，處死裸鼠，剝離腫瘤(圖1)并稱重，實驗組腫瘤組織瘤體重量明顯低于對照組(P<0.01)，抑瘤率高達68.9％(表3)。

表1 引物序列及擴增長度

表2 各組腫瘤體積的比較(±s)

表2 各組腫瘤體積的比較(±s)

組別腫瘤體積(mm3)10天16天25天45天54天60天HIF?1αmiRNA97．47±9．29143．48±10．12263．75±15．01?499．88±32．55??622．58±33．84??746．65±70．70??無意義序列107．26±13．45163．19±14．11296．89±20．00?646．18±76．14??834．80±88．73??989．15±114．93??正常104．33±10．67164．28±19．95295．94±29．65?660．89±72．01??852．38±90．01??1004．80±111．65??

注：與HIF-1α MiRNA組比較，*為P< 0.05，**為P< 0.01

圖1 3組裸鼠移植瘤剝離后的瘤體變化

1為實驗組;2為無意義序列轉移組;3為空白對照組

表3 各實驗組對裸鼠移植瘤的抑瘤率

2.2 免疫組化染色結果

免疫組化染色結果顯示，實驗組HIF-1α和survivin表達強度分別為(24.56±5.83)％和(29.08±3.99)％，明顯低于空白對照組[(69.88±6.66)％和(72.40±5.29)％]和無意義序列轉染組[(65.52±5.83)％和(68.88±4.47)％]，P均<0.01，兩對照組間差別無統計學意義，P>0.05。

2.3 HIF-1α和survivin mRNA的表達結果

HIF-1α和survivin RT-PCR檢測結果見圖2和圖3。實驗組腫瘤組織中HIF-1α 和survivin mRNA的相對表達量分別為0.06±0.01和0.44±0.21，明顯低于空白對照組(0.71±0.11和1.24±0.09)和無意義序列轉染組(0.64±0.15和1.23±0.04)(P<0.01)。空白對照組與無意義序列轉染組比較HIF-1α和survivin mRNA表達的差異均無統計學意義(P均>0.05)。

圖2 RT-PCR檢測HIF-1α mRNA表達

1為實驗組;2為無意義序列轉移組;3為空白對照組

圖3 RT-PCR檢測survivin mRNA表達

1為空白對照組;2為無意義序列轉移組;3為實驗組

2.4 細胞凋亡檢測結果

TUNEL法檢測結果顯示,實驗組凋亡細胞數為6.10±1.19，顯著高于空白對照組3.30±0.95和無意義序列對照組2.70±0.82,P<0.01,見圖4。

圖4 細胞凋亡數量統計情況

3 討論

肺癌是目前全球死亡率最高的惡性腫瘤，在我國，肺癌發病率呈逐年上升趨勢，現已成為我國城市人口癌癥死亡的首要原因。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見的類型，約占85％，據統計，肺癌患者的5年生存率約為8.9％[4]，在實體瘤中，10％～35％的腫瘤細胞處于乏氧狀態，細胞內HIF-1α表達增強是腫瘤細胞適應乏氧的1個重要原因[5]。目前，已在多種惡性腫瘤如子宮頸癌、肺癌、頭頸部癌、骨肉瘤、膠質母細胞瘤、胃癌等腫瘤及癌前病變中檢測到HIF-lα蛋白的過表達[6]，Fan等[7，8]研究發現，腫瘤分期越晚，HIF-1α表達越高，且越是發生轉移的腫瘤組織，HIF-1α表達率就越高。有研究[9]報道HIF-1α介導腫瘤細胞導致的放化療抵抗，而且使腫瘤細胞更具有侵襲性，容易發生遠處轉移，導致治療失敗，HIF-1α的諸多特性使得HIF-1α成為抗癌治療的主要靶點。因此，研究以HIF-1α為靶點的肺癌基因治療具有重要的臨床意義。

本實驗在前期研究的基礎上，應用基因沉默技術，已成功篩選出穩定轉染MiRNA質粒的肺腺癌A549細胞株，通過構建裸鼠皮下移植瘤模型，進一步在體觀察HIF-1α基因沉默對裸鼠移植瘤生長和survivin表達的影響。結果表明實驗組HIF-1α mRNA和蛋白表達均顯著降低，腫瘤生長受到抑制，腫瘤組織細胞凋亡明顯增加，survivin mRNA和蛋白表達也顯著降低，與各對照組相比，差異具有統計學意義，提示HIF-1α基因沉默有效抑制移植瘤生長，腫瘤細胞凋亡明顯增加可能與survivin表達下調有關。

survivin是凋亡抑制蛋白家族中相對分子量最小的成員，但也是迄今發現最強的凋亡抑制因子[1]，其抗凋亡機制主要是通過直接或間接抑制Caspase活性而發揮抗凋亡作用，目前，有研究發現在乳腺癌[10]、胰腺癌[11]、結直腸癌[12]中的過表達的HIF-1α上調survivin表達，體外研究采用HIF-1α基因沉默導致survivin的表達下調，表明兩者存在顯著正相關，Chen和Kirito等[13，14]研究發現HIF-1α對Notch-1和胰島素樣生長因子受體誘導的survivin的表達有協調作用，表明HIF-1α在survivin的表達調控中起著非常重要的作用，Sun等[15]在胰腺癌的在體研究發現HIF-1α和survivin的表達無相關性，可能是由于體外的人工缺氧環境不能完全模擬實體瘤內部的真實的缺氧條件，因此本實驗進一步在體探討HIF-1α基因沉默對移植瘤生長及survivin表達的影響，結果顯示實驗組survivin mRNA和蛋白表達顯著降低，凋亡細胞數量顯著增加，表明HIF-1α基因沉默抑制裸鼠移植瘤生長可能部分原因是由于下調survivin表達導致腫瘤細胞凋亡增加所致。

HIF-1α靶向治療現已成為腫瘤治療的熱點，臨床的應用前景有賴于我們對于乏氧調節腫瘤生長機制更深人的理解，隨著人們對HIF-1α參與肺癌發病機制的進一步闡明，進而可能以此為基礎開辟肺癌基因治療的新途徑。

[1]Chen YQ,Zhao CL,Li W.Effect of hypoxia-inducible factor-1alpha on transcription of survivin in non-small cell lung cancer〔J〕.Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，2009,28(1):1.

[2]Li X,Lu Y,Liang K,et al.Requirement of hypoxia-inducible factor-1alpha down-regulation in mediating the antitumor activity of the anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody cetuximab〔J〕.Mol Cancer Ther,2008,7(5):1207.

[3]Couzin J.Breakthrough of the year:RNAs make big splash〔J〕.Science，2002,298:2296.

[4]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002〔J〕.CA Cancer Clin,2005,55(2):74.

[5]Kunz M,Ibrahim SM.Molecular responses to hypoxia in tumor cells〔J〕.Mol Cancer,2003,2:23.

[6]Rankin EB,Giaccia AJ.The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis〔J〕.Cell Death & Differentiation,2008,15(2):678.

[7]Fan LF,Dong WG,Jiang CQ,et al.Role of hypoxia-inducible factor-1a and survivin in colorectal carcinoma progression〔J〕.Int J Colorectal Dis ,2008,23(11):1057.

[8]Denko NC.Hypoxia,HIF-1 and glucose metabolism in the solid tumour〔J〕.Nat Rev Cancer,2008,14(8):705.

[9]Unruh A,Ressel A,Mohamed HG,et al.The hypoxia-inducible factor-1a is a negative factor for tumor therapy〔J〕.Oncogene,2003,22(21):3213.

[10]Zhang QZ,Tang XD,Zhang ZF,et al.Nicotine induces hypoxia-Inducible factor-1AExpression in human lung cancer cells via nicotinic acetylcholine receptor-mediated signaling pathways〔J〕.Clin Cancer Res,2007,13(16):4686.

[11]Shyu KG,Hsu FL,Wang MJ,et a1.Hypoxia—inducible factor 1 alpha regulates lung adenocarcinoma cell invasion〔J〕.Exp Cell Res,2007,313(6):1181.

[12]Sotarou Enatsu,Akinori Iwasaki,Takayuki Shirakusa,et al.Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha and its prognostic significance in small-sized adenocarcinomas of the lung〔J〕.European Journal of Cardio-thoracic Surgery ,2006,29 :891.

[13]Chen YQ,Li DM,Liu HL,et al.Notch-1 signaling facilitates survivin expression in human non-small cell lung cancer cells〔J〕.Cancer Biol Ther,2011,11(1):1.

[14]Hu Y,Kirito K,Yoshida K,et al.Inhibition of hypoxia-inducible factor-1 function enhances the sensitivity of multiple myeloma cells to melphalan〔J〕.Mol Cancer Ther,2009,8(8):2329.

[15]Hong-Cheng SUN,Zheng-Jun QIU,Jun LIU.Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha and associated proteins in pancreatic ductal adenocarcinoma and their impact on prognosis〔J〕.Int J Oncol,2007,30(6):1359.