藻酸鹽萬古霉素微球制備優化評價

姜恒,許建中,侯天勇

(1.成都醫學院檢驗醫學院輸血教研室,四川 成都 610083;2.第三軍醫大學西南醫院骨科,重慶 400038)

臨床上用抗生素治療慢性骨髓炎時由于骨感染后局部失血管化和/或生物被膜的形成,致使藥物在體內病灶擴散和滲透發生障礙,全身用藥即使達到毒性劑量也不能確保足夠的局部有效治療濃度,因此尋找有效治療途徑對治療慢性骨髓炎非常關鍵。從全身用藥到局部使用慶大霉素骨水泥鏈珠,直至最近生物可降解、合成可降解的藥物緩釋技術,讓我們看到治療慢性骨髓炎新的希望。

在各種緩釋材料系統中,天然聚合物材料由于其價格低廉、來源廣泛、安全無毒并利于環保,對其開發利用也更富有吸引力,其中海藻酸鈉、殼聚糖等多糖類材料因具有極好的生物相容性和生物可降解性,有條件成為良好的給藥載體而得到廣泛的研究[1-4]。海藻酸是存在于褐藻類中的一類天然多糖,是β-D-甘露糖醛酸(簡稱M)和α-L-古洛糖醛酸(簡稱G)通過(1-4)糖苷鍵連接形成的一類線形無分枝的鏈狀陰離子聚合物,其結構特點為 G型結構如扣帶彎曲而M型結構呈帶狀伸展,所以 G型結構與鹽離子結合易形成凝膠,而M型結構與鹽離子結合易形成溶膠[5-10]。

海藻酸鹽種類繁多,其結構不同可影響理化和生物學特性[11-17]。海藻酸鈉的相對分子質量對緩釋作用的影響較大,其相對分子質量與釋藥速度之間有良好的線性關系,海藻酸鈉的相對分子質量越大,黏度越大,釋藥速度越慢。海藻酸鈉作為緩釋制劑的載體,M/G值影響緩釋作用。Akihiko等研究相對分子質量較小模型藥物的結果顯示,M/G值越大,釋放速度越快。

因此,本研究利用海藻酸鈉不同類型的特殊理化性質,根據Hou T前期試驗工作結果,對藻酸鹽萬古霉素微球進行優化。實驗中選取了高 G型、分子量較大、粘滯度較高的藻酸鹽包裹萬古霉素與氯化鈣交聯形成復合微球,并考察其相關指標的優化情況,從中篩選出較理想的品種,以便深入進行下一步實驗工作。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

藻酸鹽(Sigma):A2158為低粘度、低 G型, A0682為低粘度、低G型,A2033為高粘度、低 G型(代號 H型),A71238為低粘度、高 G型(代號 G型)。萬古霉素:標準品V2002(Sigma),實驗用品為穩可信(注射用鹽酸萬古霉素,Eli Lilly Japan K. K.)。氯化鈣:分析純,中國醫藥集團上海化學試劑公司。

1.2 主要儀器和設備

臺式離心機(Sigma);BP211D型電子天平(德國Sartorius公司);420A+PH計(美國 ThermoO-rion公司);D400型立式電熱蒸汽消毒器(上海翔運醫用設備廠);79-1型磁力熱攪機(江陰科研器械廠);高效液相色譜儀(Waters 510泵,484紫外檢測器);冷凍干燥機(Savant Modulyo);游標卡尺(TESA 0.02 mm,陜西威爾機電科技有限公司)。

1.3 方法

分別稱取上述各類一定質量的藻酸鹽溶解于去離子水中,分別配制成2%、4%、8%、10%、12%和16%溶液,分別與等體積的50 mg/mL和30 mg/ mL的萬古霉素溶液混合,攪拌10 min后,形成均一粘稠的溶液,用注射器抽取后,裝上直徑1.2 mm的注射器針頭,加壓后使藻酸鹽萬古霉素混合溶液緩慢滴入到攪動的1.01%氯化鈣水溶液中。10 min后,將從氯化鈣水溶液中收集的藻酸鹽微球用去離子水洗凈后,-70℃凍存6 h后再低壓凍干6～8 h直至重量不再變化,分裝保存。Sartorius天平(精度0.1 mg)稱取大致相同質量的由不同濃度藻酸鹽和萬古霉素溶液制備的微球,加入到5 mL的5%檸檬酸三鈉溶液中,放置在37℃的100 rpm搖床上裂解微球1 h。收集裂解液以 10 000 rpm離心10 min,取上清液在高效液相色譜儀上測定萬古霉素濃度。萬古霉素含量(%)=微球中萬古霉素質量/藻酸鹽微球的質量×100%。計算包封率:α=MV/ MA+MV,M理=M樣＊α,EE=M實/M理(其中MV為制作微球時萬古霉素總量,MA包被材料總量,M樣是抽樣檢測微球總量,M理是抽樣檢測微球所含萬古霉素理論值,M實為抽樣檢測微球裂解后的離心上清液通過高效液相色譜儀所測得萬古霉素實際含量)。再將G、H型按質量比例1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1分別配制成不同濃度溶液,重復上述方法進行檢測。同時對各組凍干微球用游標卡尺進行粒徑粗略測定。

2 結果

由表1可見,通過初篩,高 G高粘度的海藻酸鈉隨著濃度增加可明顯提高包封率。

表1 不同種類、不同濃度海藻酸鈉包封率初步比較Tab.1 Comparison of encapsulation rates of multiple concentrations and kinds of alginate sodium

3 討論

Hou T前期實驗發現,用纖維蛋白凝膠包裹的藻酸鹽微球緩釋系統結合組織工程骨聯合移植,可使局部組織獲得長達21 d的有效抗菌時間,其遠期的成骨情況良好,未見緩釋系統對于成骨的不良影響。使用纖維蛋白凝膠藻酸鹽包裹藥物微球包封率有限(20.36±0.90%),制作萬古霉素藻酸鹽緩釋微球顆粒較大(3 mm),投藥量多,在動物體內試驗中發現成骨延遲現象,表明微球顆粒占位影響成骨[18-19]。本研究就這兩方面進行優化探討,以便為進一步優化復合材料和動物體內骨組織工程實驗做好準備。

研究發現:①不同種類不同濃度海藻酸鈉包封率初步比較,高G、高粘度的海藻酸鈉隨著濃度增加可明顯提高包封率。隨著粘度、濃度增加,微球顆粒大小增加不明顯;②由于條件限制,高粘度、高 G隨濃度增加,梯度滴注制作微球會增加難度,甚至人力達不到(＜16%就很難產出球)。因此需要將高粘度、高G材料配比優化,也可降低濃度制作微球,抑或用機械化方法制作,使生產過程可靠、可控、可重復;③圖1說明所測數據差別較大,總趨勢顯示G∶H(2∶1)包封率優化結果較好。數據差別較大的原因推測可能為微球顆粒大小差異造成,在圖1結果的基礎上固定每組顆粒數,并保證組內相近總質量的情況下達到較好一致性而得到圖2,圖2顯示顆粒直徑大小與各組微球包封率大小數值無關,數據差別仍然大。圖1、2還顯示A2158微球組穩定性較好,其他組號穩定性較差,說明存在微球不均勻性。

根據上述結果,需要改進的問題有:①藥物在材料中的濃度不均一,今后在制作凝膠微球工藝方面有待進一步提高;②微球穩定性,文獻報道微球在氯化鈣溶液中孵育交聯時間越長,微球穩定性能增強;③微球與殼聚糖復合后也能使微球更加穩定,但其復合時間是關鍵,需要試驗摸索;④制作工藝中,藥物與材料混合過程中產生的氣泡是不可忽視的影響因素,需要對其抽氣處理。

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