酸橙和甜橙2種枳實(shí)藥材HPLC指紋圖譜研究及其柚皮苷和辛弗林含量分析

張振霞，鄭玉忠，梁麗娟，董婷霞，詹華強(qiáng)，趙奎君#（.韓山師范學(xué)院，潮州市504；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京市 00050；.香港科技大學(xué)中藥研發(fā)中心，香港特別行政區(qū)）

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種甜橙C.sinensis Osbeck的干燥幼果，主產(chǎn)于江西、四川、福建、江蘇等地。枳實(shí)始見于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品；2010年版《中國(guó)藥典》記載枳實(shí)具有破氣除痞、化痰消積的功效，近代臨床用于治療胃擴(kuò)張、胃下垂、子宮下垂、脫肛等臟器下垂病癥，是中醫(yī)臨床常用藥物[1]。枳實(shí)藥材來(lái)源于酸橙和甜橙，由于各產(chǎn)地的地理環(huán)境、氣候、土壤等生長(zhǎng)條件不同以及采收后加工炮制方法不同，使枳實(shí)藥材在化學(xué)成分組成及含量上差異很大，因而直接影響到藥材質(zhì)量[2～6]。本研究利用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)20個(gè)不同產(chǎn)地2個(gè)種的枳實(shí)進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立了枳實(shí)藥材的指紋圖譜；并對(duì)枳實(shí)中柚皮苷和辛弗林2個(gè)活性成分進(jìn)行含量測(cè)定，以為枳實(shí)藥材的全面質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

HPLC儀，包括Waters 600控制器、Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器、Waters 717自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、Waters Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；SB5200型超聲波清洗機(jī)（必能信超聲（上海）有限公司）；R200D型電子分析天平（德國(guó)Sartoriius公司）；R210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）。

乙腈（色譜純）和甲醇、乙醇（分析純）均購(gòu)于美國(guó)Merck公司；Mill-Q超純水（美國(guó)Millipore公司）；磷酸（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；十二烷基磺酸鈉（美國(guó)Sigma公司）；其他試劑均為分析純；辛弗林、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，批號(hào)分別為01-2008、05-1004、05-1009、05-1010，純度均＞98%）；枳實(shí)藥材2個(gè)種分別采自江西、四川、湖南、福建等不同產(chǎn)地，均經(jīng)香港科技大學(xué)中藥研發(fā)中心董婷霞教授鑒定分別為酸橙和甜橙的干燥幼果，標(biāo)本均保存于香港科技大學(xué)生物系。不同枳實(shí)樣品來(lái)源見表1。

表1 不同枳實(shí)樣品來(lái)源Tab 1 Sources ofAurantii Fructus Immaturus samples

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的制備

取柚皮苷和辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，精密稱定，用5 mL 50%乙醇溶解并定容至100 mL，搖勻，即得濃度均為1.0 mg·mL-1的柚皮苷和辛弗林的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

2.2 枳實(shí)HPLC指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（含0.1%十二烷基硫酸鈉和0.1%磷酸），梯度洗脫（0～15 min，20%A；15～25 min，20%→25%A；25～30 min，25%→33%A；30～60 min，33%→35%A）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：224 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取待測(cè)樣品細(xì)粉（過(guò)四號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加50%乙醇20 mL，超聲處理30 min（功率：240 W，頻率：40 kHz），取出，移至離心管中，于3 000 r·min-1離心5 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，作為供試品溶液。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取枳實(shí)供試品溶液（ZSHS-001和ZSHS-011）適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜2%（n＝6），表明方法精密度良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取枳實(shí)供試品溶液（ZSHS-001和ZSHS-011）適量，分別于0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜2%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一枳實(shí)樣品（ZSHS-001和ZSHS-011）適量，各精密稱取6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，記錄色譜圖并進(jìn)樣分析。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜2%，而相對(duì)峰面積的RSD均＜5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3 柚皮苷和辛弗林含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；柚皮苷和辛弗林的流動(dòng)相分別為乙腈-水（含0.1%磷酸）＝21∶79、乙腈-水（含0.1%十二烷基硫酸鈉和0.1%磷酸）32∶68，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為283 nm和224 nm；柱溫：室溫；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 供試品溶液的制備 取待測(cè)樣品細(xì)粉（過(guò)四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加50%乙醇25 mL，超聲處理30 min（功率：240 W，頻率：40 kHz），取出，移至離心管中，于3 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，殘?jiān)靡掖荚偬崛?次，合并提取液，然后用50%乙醇定容至100 mL，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，用50%乙醇稀釋成6個(gè)不同濃度的柚皮苷和辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度（X，g·mL-1）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得柚皮苷和辛弗林的回歸方程分別為Y＝15 011X－12 750（r＝0.999 5）、Y＝32 887X－29 459（r＝0.999 4）。結(jié)果表明，柚皮苷和辛弗林的檢測(cè)濃度均在10～200 g·mL-1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定。結(jié)果，柚皮苷峰面積的RSD＝1.35%（n＝6），辛弗林峰面積的RSD＝0.588%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一枳實(shí)供試品溶液（ZSHS009和ZSHS011，用于測(cè)定柚皮苷含量；ZSHS003，用于測(cè)定辛弗林含量）適量，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣，記錄柚皮苷和辛弗林的峰面積。結(jié)果，其RSD分別為0.92%、1.61%和1.05%（n均為7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取枳實(shí)樣品ZSHS009和ZSHS011（用于測(cè)定柚皮苷含量）以及ZSHS003（用于測(cè)定辛弗林含量）適量，各6份，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定柚皮苷和辛弗林的含量。結(jié)果，其RSD分別為1.34%、1.47%和2.00%（n均為6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 稱取枳實(shí)樣品ZSHS009和ZSHS011（用于測(cè)定柚皮苷含量）以及ZSHS003（用于測(cè)定辛弗林含量）適量，各6份，精密稱定，分別精密加入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定柚皮苷和辛弗林的含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，柚皮苷的平均回收率為93.76%和96.19%，RSD為1.01%和2.04%（n均為6）；辛弗林的平均回收率為94.8%，RSD＝2.52%（n＝6）。

3 結(jié)果

3.1 枳實(shí)HPLC指紋圖譜的測(cè)定與分析

3.1.1 樣品指紋圖譜測(cè)定 對(duì)來(lái)自20個(gè)不同產(chǎn)地的枳實(shí)樣品進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)藥材中所有成分均能在60 min內(nèi)被洗脫出來(lái)。色譜見圖1。

比較20個(gè)枳實(shí)樣本的色譜圖，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地間的差異并不明顯，而種間的差異非常顯著。雖然2種枳實(shí)都含有柚皮苷和辛弗林，但它們的共有成分不完全相同，詳見圖2。從圖2中可以看出，酸橙所含的成分比甜橙多。

3.1.2 指紋圖譜的相似度計(jì)算 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”對(duì)20批枳實(shí)藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枳實(shí)2個(gè)種間的圖譜差異較大，20批藥材的相似度用中位數(shù)矢量計(jì)算結(jié)果均＜0.650。不同種的枳實(shí)樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果見表2。

圖1 高效液相色譜圖A.空白對(duì)照；B.混合標(biāo)準(zhǔn)品；C.酸橙ZSHS-001；D.甜橙ZSHS-011Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank control；B.mixed control；C.C.aurantium ZSHS-001；D.C.sinensis ZSHS-011

圖2 枳實(shí)20批樣品的HPLC指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprints of 20 batches of Aurantii Fructus Immaturus samples

表2 不同種的枳實(shí)樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果Tab 2 Similarity analysis results of fingerprints of Aurantii Fructus Immaturus samples from different species

從表2可以看出，10批酸橙的相似度均＞0.98，說(shuō)明各產(chǎn)地的酸橙樣品色譜模式相似，其化學(xué)成分一致性好；10批甜橙的平均相似度僅為0.85，總體來(lái)說(shuō)各產(chǎn)地的甜橙樣品色譜圖基本一致，不同產(chǎn)地甜橙藥材相似度有一定差異。

3.2 柚皮苷和辛弗林的含量測(cè)定結(jié)果

對(duì)20批枳實(shí)樣品，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別在283 nm和224 nm波長(zhǎng)下測(cè)定柚皮苷和辛弗林的峰面積，根據(jù)其線性回歸方程分別計(jì)算二者的含量，結(jié)果見表3。

表3 20批枳實(shí)樣品中柚皮苷和辛弗林的含量測(cè)定結(jié)果Tab 3 Content determination of naringin and synephrine in 20 batches ofAurantii Fructus Immaturus

從表3可以算出，不同產(chǎn)地的酸橙藥材中柚皮苷和辛弗林的含量分別介于8.45%～15.32%和0.16%～0.46%之間；不同產(chǎn)地的甜橙藥材中柚皮苷和辛弗林的含量分別介于0.17%～3.66%和0.37%～1.23%之間。在枳實(shí)的2個(gè)種間，柚皮苷和辛弗林成分含量變化的趨勢(shì)明顯不同。

4 討論

4.1 辛弗林首次作為指標(biāo)峰用于枳實(shí)的指紋圖譜

辛弗林是枳實(shí)中生物堿類的主要代表，《中國(guó)藥典》一直將其作為考察枳實(shí)藥材的指標(biāo)性成分[1]；但在枳實(shí)的指紋圖譜中卻很少將辛弗林作為指標(biāo)峰。為了真實(shí)地反映枳實(shí)的主要成分，本研究首次將辛弗林作為枳實(shí)指紋圖譜的指標(biāo)峰加以研究。由于辛弗林是生物堿，一般都采用十二烷基硫酸鈉為緩沖溶液，以延緩辛弗林的出峰時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果表明，選擇乙腈-水（含0.1%十二烷基磺酸鈉和0.1%磷酸）作為流動(dòng)相梯度洗脫，能保證樣品的分離度和峰的數(shù)目。同時(shí)，在224 nm波長(zhǎng)（辛弗林的最大吸收波長(zhǎng)）下各峰分離良好、特征性強(qiáng)、峰數(shù)較多，對(duì)枳實(shí)中黃酮類物質(zhì)基本不產(chǎn)生影響。

4.2 枳實(shí)中2個(gè)種間的指紋圖譜比較

比較枳實(shí)2個(gè)種的色譜圖可知，產(chǎn)地間的差異并不明顯，而種間的差異非常顯著。從圖2中可以看出，甜橙含有的橙皮苷的量（峰）比酸橙高很多；酸橙含有新橙皮苷，甜橙則幾乎未發(fā)現(xiàn)該峰?？梢哉J(rèn)為，橙皮苷是甜橙的特有峰，新橙皮苷是酸橙的特有峰。但是否可以將其作為區(qū)分酸橙和甜橙的標(biāo)志成分，還需進(jìn)一步研究。

4.3 枳實(shí)中2個(gè)種間的有效成分含量比較

柚皮苷一直被《中國(guó)藥典》用作考察枳殼藥材的指標(biāo)性成分，并且規(guī)定枳殼中柚皮苷含量不得少于4%[1]，但在枳實(shí)中卻未采用。從表3可以看出，柚皮苷在枳實(shí)中2個(gè)種間的含量差異非常明顯：所有酸橙中的柚皮苷含量超過(guò)8%，最高的超過(guò)15%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)；但所有甜橙中的柚皮苷含量?jī)H在0.17%～3.66%之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥典標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)于枳實(shí)，《中國(guó)藥典》規(guī)定辛弗林的含量不少于0.3%。從測(cè)定結(jié)果可以看出，辛弗林在枳實(shí)2個(gè)種間的差異也非常明顯。但是，除了樣本ZSHS-007、ZSHS-009和ZSHS-010之外，所有枳實(shí)樣品的辛弗林含量都高于藥典標(biāo)準(zhǔn)。一般來(lái)說(shuō)，辛弗林含量會(huì)隨藥材的生長(zhǎng)程度呈規(guī)律性變化，即果實(shí)越趨成熟，辛弗林含量越低[7]。因此，其原因可能與產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、采收期、加工方法等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

4.4 通過(guò)柚皮苷和辛弗林的含量差異分析枳實(shí)藥材的復(fù)雜性

從本質(zhì)來(lái)看，枳實(shí)和枳殼雖然只是大小和生長(zhǎng)期的差別，但是通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)，枳實(shí)藥材遠(yuǎn)比枳殼藥材復(fù)雜。橙的柑果分酸橙和甜橙，酸橙味酸帶苦，不宜食用，多用于制成枳實(shí)和枳殼等藥材；鮮食水果則以甜橙為主。在幼果期，柑橘類植物會(huì)產(chǎn)生自然落果，或農(nóng)民進(jìn)行科學(xué)疏果以保證柑橘質(zhì)量，為了增加收入，農(nóng)民往往將這類落果或疏出的幼果制成甜橙枳實(shí)。與酸橙枳實(shí)比較，這類枳實(shí)的個(gè)頭多數(shù)很小，其所含的辛弗林含量較高。這使得枳實(shí)包含了酸橙和甜橙兩大類，有可能還包含了更多的其他栽培變種。當(dāng)柑橘長(zhǎng)大以后，就只有酸橙被制成枳殼，而甜橙類則會(huì)作為水果出售，這就使得枳殼藥材的品種來(lái)源較一致，成分也一致。當(dāng)然，實(shí)際原因還有待于進(jìn)一步調(diào)查研究。

由于枳實(shí)的品種來(lái)源復(fù)雜，導(dǎo)致其成分變化也非常復(fù)雜。以柚皮苷為例，可以看出酸橙中的柚皮苷含量遠(yuǎn)高于甜橙的柚皮苷含量。袁旭江等[8]發(fā)現(xiàn)，化橘紅中柚皮苷含量隨果齡果徑增長(zhǎng)而遞減，這是因?yàn)樗岢辱讓?shí)的柚皮苷含量遠(yuǎn)高于酸橙枳殼。

綜上，不同產(chǎn)地枳實(shí)由于生長(zhǎng)條件、果齡不同以及采收后加工炮制方法不同，都會(huì)影響藥材中各成分含量的變化。辛弗林可以作為不同來(lái)源的枳實(shí)的指標(biāo)性成分；而在測(cè)定柚皮苷時(shí)必須分清枳實(shí)的品種。

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